小鼠（Mouse）免疫球蛋白ELISA检测试剂盒实验原理

小鼠（Mouse）免疫球蛋白ELISA检测试剂盒检测原理
试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验 （ELISA） 。 往预先包被免疫球蛋白G（IgG）抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、 HRP标记的检测抗体， 经过温育并*洗涤。 用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色， 并在酸的作用下转化成Z终的黄色。颜色的深浅和品中的免疫球蛋白G（IgG）呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值） ，计算样品浓度。
样品收集、处理及保存方法
1. 血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞
刺激，收集血液后，3000 转离心 10 分钟将血清和红细胞迅速小心地
分离。
2. 血浆： EDTA、 柠檬酸盐或肝素抗凝。 3000 转离心 30 分钟取上清。
3. 细胞上清液：3000 转离心 10 分钟去除颗粒和聚合物。
4. 组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。3000 转离心 10 分钟
取上清。
5. 保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于
-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。
自备物品
1. 酶标仪（450nm）
2. 高精度加样器及枪头： 0.5-10uL、 2-20uL、 20-200uL、 200-1000uL
3. 37℃恒温箱
小鼠（Mouse）免疫球蛋白ELISA检测试剂盒操作注意事项
1. 试剂盒保存在 2-8℃，使用前室温平衡 20 分钟。从冰箱取出的
浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶*溶解
后再使用。
2. 实验中不用的板条应立即放回自封袋中， 密封 （低温干燥） 保存。
3. 浓度为 0 的 S0 号标准品即可视为阴性对照或者空白；按照说明
书操作时样本已经稀释 5 倍，Z终结果乘以 5 才是样本实际浓度。
4. 严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。
5. 所有液体组分使用前充分摇匀。
试剂的准备
20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按 1：20 稀释，即 1 份的 20×洗涤缓
冲液加 19 份的蒸馏水。
洗板方法
1. 手工洗板：甩尽孔内液体，每孔加满洗涤液，静置 1min 后甩尽
孔内液体，在吸水纸上拍干，如此洗板 5 次。
2. 自动洗板机：每孔注入洗液 350μL，浸泡 1min，洗板 5 次。
操作步骤
1. 从室温平衡 20min 后的铝箔袋中取出所需板条， 剩余板条用自封
袋密封放回 4℃。
2. 设置标准品孔和样本孔， 标准品孔各加不同浓度的标准品 50μL；
3. 样本孔先加待测样本 10μL，再加* 40μL；空白孔不
加。
4. 除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶
（HRP）标记的检测抗体 100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴
锅或恒温箱温育 60min。
5. 弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置 1min，甩去
洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板 5 次（也可用洗板机洗板） 。
6. 每孔加入底物 A、B 各 50μL，37℃避光孵育 15min。
7. 每孔加入终止液 50μL，15min 内，在 450nm 波长处测定各孔的
OD 值。
结果判断
绘制标准曲线：在 Excel 工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应
OD 值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样
本浓度值。
试剂盒性能
1. 准确性：标准品线性回归与预期浓度相关系数 R 值，大于等于
0.9900。
2. 灵敏度：Z低检测浓度小于 0.1 mg/mL。
3. 特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。
4. 重复性：板内、板间变异系数均小于 15%。
5. 贮藏：2-8℃，避光防潮保存。
6. 小鼠（Mouse）免疫球蛋白ELISA检测试剂盒有效期：6 个月