受支原体污染的ATCC细胞检测法

支原体污染会影响ATCC细胞的形态、功能、代谢、细胞膜、生长速率、诱导染色体畸变、细胞内信号传导等各种细胞特性。受支原体污染的细胞在培养时培养基的pH值不会发生改变, 也不会浑浊,因此, 很难直接观察出细胞是否受到污染。常用的支原体检测方法有培养法、DNA荧光染色法、酶联免疫吸附法和PCR法等。

1. 培养法

培养法是Z传统的检测方法, 该方法能直观地显示是否存在支原体污染。将细胞培养物置于PPLO肉 汤 培 养 基(pleuropneumo-nia-like organismsbroth base)中, 37 °C培养3天后离心, 将沉淀物转移至PPLO琼脂培养基相同条件下培养4~6周, 观察是否有“煎鸡蛋”样菌落出现, 若有即为支原体污染。

这种方法简单易行, 但耗时比较长, 且存在不少缺陷。支原体由于遗传缺陷, 导致某些代谢途径缺失, 其生长很大程度依赖于培养基的成分。在
配制培养基时, 任何成分质量或批次的不同都会影响支原体的生长, 从而影响检测的灵敏度。不同的生长条件(如好氧、厌氧、微氧等)也会影响检测结果, 易导致假阳性。此外, 还有许多支原体无法培养, 因此, 使用培养法的检测结果并不全面。

2. DNA荧光染色法

DNA荧光染色法是基于使用荧光染料DAPI或Hoechst 33258的细胞化学染色法。荧光染料能选择性的结合ATCC细胞和支原体DNA的小沟, 因此, 在准备过程中, 任何存在的DNA均会被染色且DNADAPI复合物吸收波长为340~488nm。将待测细胞单层培养至70%~90%汇合度时,  以5×104/mL~1×105/mL浓度转接至盖玻片上培养12~24小时, 用无菌磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤, 并在37 °C下用DAPI-甲醇溶液染色15分钟, 无菌水洗涤
并烘干后置于柠檬酸缓冲液(pH5.5)?甘油(2?1)条件中, 用指甲油密封。处理后的玻片置于荧光显微镜下观察, 被支原体污染的细胞经染色后, 细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一的荧光点。

3. ELISA法

酶促反应作为生物化学检测手段可应用于培养细胞中支原体的检测, 如通过测乙酸激酶、氨基甲酸激酶等各类酶的活性, 能快速、灵敏地对
细胞培养物进行筛选检测。酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbnentassay, ELISA)试剂可通过商业渠道购买, 其中包括针对细胞培养过程中常见支原体/胆甾原体抗原的多克隆抗体。用于检测的抗体与生物素共轭结合后, 链霉亲和碱性磷酸酶水解4-硝基苯基磷酸生成黄色的硝基苯酚产物, 在405 nm波长下通过酶标仪量化。ELISA检测支原体污染有较好的特异性和敏感性, Z显著的优点是能一次检测大量样品。

4. 基于DNA聚合酶链式反应(PCR)的扩增检测

PCR技术是根据DNA高温变性、低温退火、适温延伸的原理进行的扩增技术。自Uemori等公布了12种支原体16S-23S rRNA区域的序列后, 应用PCR技术进行支原体检测的研究迅速发展。16S、16S-23S、23S rRNA是支原体基因组内的保守区域, 根据这些区域的序列设计特异性引物, 使用PCR的方法扩增后, 利用琼脂糖凝胶电泳进行检测, 通过比对分析扩增产物的大小, 可进行支原体感染的初步分析鉴定。PCR检测法与传统培养或荧光染色技术相比,
ATCC细胞具有快速、稳定、易重复及灵敏度高等特点。但易受其他污染物如细菌、真菌影响导致假阳性结果, 且仍处于实验室研究阶段, 尚无标准、准确的一套检测方案。