如何运用生物化学方法检测细胞凋亡？

早期细胞凋亡检测及活细胞的胞膜正常，DNA染料碘化丙锭(PI)拒染，但可被另外一种DNA染料Hoechst342(Ho342)染色；而坏死细胞的胞膜完整性受到破坏，细胞不需固定即可被PI染色。凋亡细胞的胞膜成分亦发生改变，在凋亡早期，原来位于细胞膜内侧的磷脂酰*(PS)迁移至脂双层外侧。另外，细胞凋亡时核酸内切酶被激活，首先将DNA切成50～300kb大小的DNA，然后进一步将染色质裂解成单个核小体和寡聚核小体，形成180～200bp的DNA。而坏死细胞DNA断裂无规律性。

本文综述了细胞凋亡的生物化学检测方法。
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一、Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测方法
原理：在正常细胞中，磷脂酰*只分布在细胞膜脂质双层的内侧，细胞发生凋亡早期，膜磷脂酰*（PS）由脂膜内侧翻向外侧，这一变化早于细胞皱缩、染色质浓缩、细胞膜的通透性增加等凋亡现象。

AnnexinV是一种磷脂结合蛋白，与磷脂酰*有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰*与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此AnnexinV被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。 

碘化丙啶（Propidium Iodide,PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但凋亡中晚期的细胞和死细胞由于细胞膜通透性的增加，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。 

因此，将Annexin V与PI联合使用时，PI 则被排除在活细胞（Annexin V-/PI-）和早期凋亡细胞（Annexin V+/PI-）之外，而晚期凋亡细胞和坏死细胞同时被FITC 和PI 结合染色呈现双阳性（Annexin V+/PI+）。

检测方法：1.按照既定程序诱导细胞凋亡；2.按照说明书配制所需溶液；3.常规制备单细胞悬液，用冷PBS洗两次后，取约5×106个细胞，1500rpm离心，弃上清，将细胞悬浮在400 µl×结合溶液中；4.将细胞悬液分成5管，每管约1×106个细胞，阴性对照管不加任何试剂，阳性对照管加2%多聚甲醛固定30分钟，用FITC标记Annexin V和PI双染，余下3管，其中1管只加10 µl PI，1管只加5 µl FITC标记Annexin V，后一管加10 µl PI和FITC标记Annexin V混合，室温孵育15分钟；5.每管各加400 µl 1× 结合缓冲液上机检测。

注意事项：A.确定细胞凋亡发生的时间，PS外翻只发生在细胞凋亡早期，建议先观察细胞凋亡的形态后决定取样检测时间；B.由于EDTA会络合Ca2+离子，影响Annexin V与PS的结合，因此建议不用含EDTA的*消化贴壁细胞。细胞凋亡检测经过*消化后可能导致*对细胞的进一步作用从而导致细胞的进一步凋亡，建议在用*处理前单独收集培养液中悬浮的细胞，保存在2%的BSA中。
 
二、磷脂酰*单抗（PS）检测法
原理：与Annexin V相比，PS的抗体可以直接用来检测细胞凋亡过程中PS的外翻，而且灵敏度高，特异性强，信号持续时间久，费用更低。
 
三、TUNEL法
原理：TUNEL的全称是Terminal Deoxynucleotidyl Transferase mediated dUTP Nick-End Labeling，中文名为末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP原位切口末端标记。

细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程，染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300kb的大片段。然后大约30 ﹪的染色体DNA在Ca ²+和Mg²+依赖的核酸内切酶作用下，在核小体单位之间被随机切断，形成180～200bp核小体DNA多聚体。DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3’-OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或*形成的衍生物标记到DNA的3’-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）。

由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3’-OH形成，很少能够被染色。低分子量的DNA分离后，也可使用DNA聚合酶进行缺口翻译（nick translation），使低分子量的DNA标记或染色，然后分析凋亡细胞。

TUNEL或缺口翻译法实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确的反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞凋亡测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，灵敏度远比一般的组织化学和生物化学测定法要高，因而在细胞凋亡的研究中已被广泛采用。

不足之处：
(1)坏死细胞亦有DNA裂点形成,也可呈现TUNEL反应阳性，因而特异性较差。据报道，TUNEL反应中坏死细胞的标记量比凋亡细胞的标记量少一个数量级。
(2)TUNEL结合免疫组化检测时，细胞凋亡检测固定过程对检测的影响较大，切片的大小、薄厚会直接影响到固定效果，从而产生结果的差异。