ELISA - 方法类型和操作步骤

来源：上海基免实业有限公司 2014年01月02日 14:40

      ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。该法适于测定细胞培养上清、血清、血浆及组织液中的样本，干扰小可以测到每毫升纳克水平的细胞因子（或受体）的水平。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体，②酶标记的抗原或抗体，③酶作用的底物。

根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。

（一）双抗体夹心法双抗体夹心法是检测抗原zui常用的方法，

      （二）双位点一步法在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步（图15-5）。这种双位点一步不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。

      在一步法测定中，应注意钩状效应（hookeffect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。

      （三）间接法测抗体间接法是检测抗体zui常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。

      本法只要更换不同的固相抗原，可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。

（四）竞争法竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。
      （五）捕获法测IgM抗体血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗本多用捕获法，先将所有血清IgM（包括异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再测定特异性IgM。

      （六）应用亲和素和*的ELISA亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每个分子由4个亚基组成，可以和4个*分子亲密结合。现在使用更多的是从链霉菌中提取的链霉和素（strepavidin）。*（biotin）又称维生素H，分子量244.31，存在于蛋黄中。用化学方法制成的衍生物，*－羟基琥珀亚胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成*化的产物。亲和素与*的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。由于1个亲和素分子有4个*分子的结合位置，可以连接更多的*化的分子，形成一种类似晶格的复合体。因此把亲和素和*与ELIS偶联起来，就可大提高ELISA的敏感度。

      亲和素－*系统在ELISA中的应用有多种形式，可用于间接包被，亦可用于终反应放大。可以在固相上先预包被亲和素，原用吸附法包被固相的抗体或抗原与*结合，通过亲和素－*反应而使*化的抗体或抗在相化。这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量，而且使其结合点充分暴露。另外，在常规ELISA中的酶标抗体也可用*化的抗体替代，然后连接亲和素－酶结合物，以放大反应信号。

      ELISA 普遍用作非放射性同位素的成键化验. 在这种方法中，通常标准配体是固定的，通过加入溶液相受体或蛋白质来使之成键. 通过加入与受体特异性反应的抗体来定量成键的受体，而且zui初抗体的量以加入第二种能显色的抗体测量. 第二种抗体能识别抗体的末端，在其末端的碱性磷酸酯或过氧化物酶等与酶发生反应，从而使溶液显色.

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