整个过程大致如下:
1. 创建miRNA模拟物。
2. 将这些miRNA模拟物和pMirTrap载体共转染到哺乳动物细胞,并孵育24小时。同时利用miR-132、pMirTrap载体和pMirTrap对照载体开展对照转染。
3. 利用附带的MirTrap分离试剂盒裂解转染后的细胞培养物。
4. 利用分离试剂盒中的磁珠对RISC复合物(其中包括靶标mRNA)进行免疫沉淀。
5. 利用附带的NucleoSpin RNA XS试剂盒分离与磁珠结合的靶标mRNA。
6. 通过qPCR或新一代测序分析分离出的RNA,鉴定出特定miRNA的靶标mRNA。
MirTrap系统中包含了pMirTrap载体、免疫沉淀及后续分离所需的试剂、Xfect microRNA转染试剂以及对照试剂,足够15次分析使用。
Xfect microRNA转染试剂也是Clontech推出的产品。它形成可生物降解的纳米颗粒,从而实现miRNA的转染。此试剂盒提供两种转染聚合物:Xfect MicroRNA Transfection Polymer,这是为小RNA的转染而优化的;Xfect Polymer,这是为质粒DNA而优化的。
在miRNA转染时,只需要Xfect MicroRNA Transfection Polymer;而在miRNA与质粒DNA的共转染时,须在转染反应中加入少量的Xfect Polymer。
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