南京信帆生物：Sigma去糖基化试剂盒之使用心得

来源：南京信帆生物技术有限公司 2016年05月25日 22:03

Sigma-Aldrich的天然蛋白去糖基化试剂盒（Native Protein Deglycosylation Kit，货号NDEGLY）可在天然条件下去除糖蛋白上的N连接寡糖。糖基化蛋白修饰通常位于折叠蛋白中不容易接近的位置，因此在未变性的情况下，不大可能通过标准的肽N- 糖苷酶 F（PNGase F）处理来去除。如果您的下游分析需要折叠蛋白（如酶学分析或蛋白相互作用分析），那么这个试剂盒也许适合您。

此试剂盒包含了内糖苷酶F1、F2和F3，以及相应的反应缓冲液。与PNGase F相比，这些内糖苷酶对蛋白构象没那么敏感，更适合在蛋白未变性的情况下去除各种N连接寡糖。这三种内糖苷酶有着不同的连接特异性。F1能够去除低聚甘露糖和混合寡糖结构，而F2和F3则分别能去除两个分支和三个分支的结构。

此试剂盒在去糖基化上的效果如何呢？美国西北大学的博士生A. Caulfield介绍了他的使用心得。

据Caulfield介绍，他们想要确定目的蛋白在去糖基化之后的生物学活性。糖基化的去除可通过Western blot来评估，即蛋白条带的分子量减少。他们的目的蛋白包含N连接糖基化。此蛋白在HEK 293细胞中产生，并利用其N端的FLAG标签来纯化。之前他们试过PNGase，但无法让目的蛋白去糖基化。

在这一实验中，他们将2 ug目的蛋白与0.02个单位的内糖苷酶F1、F2或F3及其相应的缓冲液混合，在37°C孵育4小时。之后通过标准的SDS-PAGE和Western blot来评估去糖基化的程度。

正如他们预计的那样，蛋白被去糖基化，且各个样品之间的结果相当一致。有趣的是，内糖苷酶F1对他们的蛋白起作用，而F2和F3则*没效果。Caulfield认为，了解哪种酶能使蛋白去糖基化，将带来一些有关寡糖链性质的信息。

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