同科生物同源重组试剂盒实验中常见问题与解决方案

同科生物同源重组试剂盒实验中常见问题与解决方案

一、平板上无克隆或克隆数目很少

1、可能的原因：引物序列不正确

解决方案：确认引物序列含有15 bp与载体插入区域*一致的同源序列。

2、可能的原因：PCR产物不纯

解决方案：优化PCR扩增反应以得到单一PCR产物；换一种纯化方法，纯化您的PCR产物。

3、可能的原因：反应体系中DNA浓度太低

解决方案：在重组反应中，加入推荐的DNA量。

4、可能的原因：不纯的载体或插入片段抑制重组反应

解决方案：推荐采用胶回收或离心柱法纯化DNA后进行重组反应。

5、可能的原因：转化过程中加入重组反应液过多

解决方案：重组反应液的转化体积不应超过转化细胞体积的1/10。

6、可能的原因：感受态细胞转化效率低

解决方案：更换新鲜、的感受态细胞。

7、可能的原因：培养基中加入错误或过多抗生素

解决方案：在转化平板中加入正确、适量的抗生素。

二、假阳性克隆数目多

1、可能的原因：克隆载体线性化不*

解决方案：重新酶切您的载体，增加酶切时间，并胶回收纯化。

2、可能的原因：PCR使用的模板质粒抗性与所需克隆载体抗性相同造成的污染

解决方案：可在PCR反应之前先将模板质粒线性化；PCR产物用DpnI处理，消化模板质粒，然后再纯化。

3、可能的原因：转化用平板放置时间过长导致抗性失效

解决方案：确认平板新鲜配置，并含有正确、适量的抗生素。

三、克隆含有不正确的插入片段

可能的原因：PCR产物混有非特异性片段

解决方案：优化PCR扩增体系，提高特异性或胶回收纯化目的片段。