酶联免疫测定（ELISA）酶的色原底物

HRPzui常用的色原底物有邻苯二胺（OPD）、2，2’—吖嗪—（3—乙酰苯基噻唑磺酸—6）[2，2’—azino-di（3—ethylben2thiazolinesulphonicacid-6），ABTS]（杂环吖嗪）、四甲基联苯胺（TMB）和4—氨基*：*耦联底物对等。上述色原底物受HRP作用主要有两种方式的反响：①氧化复原底物的氧化作用，如OPD、ABTS等；②一个氨基芳香剂与另一个芳香基化合物的氧化耦联，如4—氨基*：*等。
（一）氧化复原色原底物
 OPD被以为是HRPzui为活络的色原底物之一，其在HRP的作用下，由过氧化氢（H202）
氧化而聚合成2，2’—二氨基偶氮苯（DAB）。在pH5．0左右时，DAB在波长450nm处有广规模的zui大吸收，当pH值降为1．0时，zui大吸收波长移动至492nm，一起摩尔消光系数变大，显色加深（图4—2）。因而常用强酸如硫酸或盐酸停止反响。实践工作中，用强酸尤其是盐酸停止反响后，显色并不安稳，常随时刻增加而色彩加深，这是因为反响后剩下的过氧化氢继续氧化OPD而发作非酶催化的DAB的成果。有人在强酸反响停止液中参加复原剂如亚硫酸钠，因复原剂可敏捷*地将剩下的过氧化氢复原而阻挠了OPD的非酶氧化，成果显色安稳，数十小时内不变，并且无需避光。OPD的缺点是其对机体具有致骤变作用。因为OPD的不安稳性，现在的产品试剂盒中，OPD均以片剂或粉剂供应，临用时再溶解于相应的缓冲液。
在ELISA测守时，OPD色原底物的详细配方为①显色底物溶液：在0．1mol／L枸橼酸盐缓冲液（pH5．0）中含20 mmol／L OPD和12 mmo!／L H202，或10 mmol／L OPD和5．5mmol／L H202；②停止液：2 mol／L硫酸（含0．1 mol／L亚硫酸钠）；③测定波长：492nm。
TMB是一种优于OPD的新型HRP色原底物。其氧化产品联苯醌在波长450nm处有zui大消光系数，如果HRP量少，*和TMB过量时，则构成蓝色的阳离子根。下降pH，即可使蓝色的阳离子根转变为黄色的联苯醌（图4—3）。运用硫酸作为停止剂可使产品安稳90min，但随后本底显色就不断加深，国内有人以为运用1％SDS作为停止剂，可使鲜蓝色24h内坚持不变，阴阳性比照非常显着，但在我们实验室发现1％SDS对上述显色有较强的褪色作用，现在仍以硫酸作为停止剂较为理想。ELISA中，底物反响显色后，常挑选其具zui大吸收的波长450nm比色测定成果。而’Madersbacher和Berger等为进步以TMB作底物的ELISA测定的活络性，挑选显色呈指数加深时的波长405nm比色测定。他们首要测定一系列已知浓度的规范品在450nm和405nm的值，证实A450nm／A405nm之比为3．2，然后在运用波长405nm测定含低浓度待测物的标本得到的OD值再乘以常数3．2，即为待测标本在波长450nm处的真值。该种双波长测定办法可使ELISA测定规模进步3倍。TMB的显色反响虽与OPD一样同属氧化复原反响，但前者的反响是可逆的，如停止液中存在复原剂（*及亚硫酸钠、SDS等），则可反响显色敏捷衰退。TMB尽管溶解度相对较低，但因为其高检测活络性及无致骤变作用，现已基本上替代了OPD而成为HRPzui为常的色原底物。
在产品ELISA试剂盒尤其是国内的产品中，TMB色原底物常为已配好的A及B两种液态试剂，其间一种是含必定浓度过氧化氢的溶液，一种为TMB溶液，鉴于过氧化氢、TMB在溶液中相对不安稳的特点，因而，我们在运用ELISA试剂盒时，如发现底物A和（或）B呈现色彩，或二者各取一滴混合后显色，阐明该试剂盒的底物溶液已蜕变或已受污染，有必要抛弃。
在ELISA测守时，TMB色原底物的详细配方为①显色底物溶液：先将TMB以0．1 mol／L的浓度溶于二甲亚砜，然后，再将其以1 mmol／L和H202以3．0 mmol／L的浓度溶于0．2mol／L醋酸钠／枸橼酸缓冲液（pH4．0），即可使用。②停止液：2 mol／L硫酸。③测定波长：450nm。
ABTS也是HRP的一种高活络底物。在H：O：存鄙人，ABTS的氨盐转变为易发作歧化的阳离子根（图4—4）。阳离子根为绿色，与OPD的黄色氧化产品相比更适于可见光测定（测定波长入＝414nm）。上述显色也不安稳，10 mmol／L叠氮钠是较为理想的停止剂，可使显色安稳数十小时，且可削减阳离子根的歧化。另有人报导用1．25％NaF停止反响作用较好。
ABTS在现在国内的ELISA试剂盒中基本上没有使用，但在国外ELISA试剂盒偶见有使用。
在ELISA测守时，ABTS色原底物的详细配方为①显色底物溶液：先将ABTS以2 mmol／L和H202以2．5 mmo!／L的浓度溶于0．1 mol／L醋酸盐缓冲液（pH 4．2），即可使用；②停止液：10 mmol／L叠氮钠；③测定波长；414nm或405nm。
除上述三种外，HRP的氧化复原底物尚有O-dianisidine（ODA），5—氨基水杨酸（5—AS）以及dicarboxindine等。
（二）氧化耦联色原底物对
HRP的氧化耦联色原底物对主要有4—氨基*：*耦联底物对（Trinder试剂）和2—甲基—2—苯并噻唑啉腙（MBTH）；二甲基苯胺（DMA）耦联底物对（Ngo—Lenhoff试剂）等。
在H202存鄙人，4—氨基*和*经HRP作用缩合构成赤色的醌亚胺，其在入＝492 nm处有zui大吸收（图4—5）。
该耦联色原底物对用于固相ELISA时，活络性一般较低，反响见光不安稳，并且*易发作多聚化，缺少恰当的反响停止剂。因而，该试剂常限于葡萄糖、三酰甘油、肌酸激酶等临床生化指标的酶法检测使用。1989年日本学者用其作为色原底物建立了一种以HRP作符号酶的均相酶免疫实验，可用甲醛停止反响。但这种办法仅停留在实验室阶段，这以后也未见有其他实验室的使用报导，可能还有其固有的缺点。
4—氨基*：*耦联底物对色原底物的详细配方为①显色底物溶液：将4—氨基*以2 mmol／L，*以25 mmol／L和H202以0．8 mmol／L的浓度溶于0．1 mol／L磷酸盐缓冲液（pH7．2），即可使用；②停止液：未见报导；③测定波长：492nm。
MBTH和DMA在HRP的作用下缩合生成紫蓝色的吲达胺（indamine），zui大吸收波长为590nm，见光不安稳。用盐酸或硫酸停止反响后，pH应为3．0左右，pH值的下降使显色从紫蓝色转变为清晰的蓝色，zui大吸收波长从590nm变为595nm，但是pH值的进一步下降，将导致光吸收消失。
MBTH：DMA耦联对在固相ELISA测定几乎没有使用。