RNA结合蛋白(RBPs)在转录后水平调节基因的表达起着重要的作用,具体的作用包括mRNA前体的剪接、多腺苷化和稳定性的维持,mRNA从细胞核向细胞质的运输,mRNA的定位和翻译等。RBPs在这些过程中的调节作用是通过结合新合成的或者成熟后的转录物的特定序列实现的。于此同时,有很多RBPs能够识别RNA中的特定核苷酸序列。
RNA pulldown方法,其特征在于,包含以下步骤:S1、磁珠预处理:使用BSA和寡核苷酸随机引物封闭链霉亲和素标记的磁珠;S2、制备探针‑磁珠复合物:将步骤S1预处理的磁珠与*标记的RNA探针结合;S3、提取并预处理细胞全蛋白:向提取的细胞全蛋白中加入脱氧核糖核酸酶孵育,再加入未预处理的磁珠孵育,去除磁珠,收集上清;S4、pulldown:将步骤S3收集的上清加入到步骤S2制备的探针‑磁珠复合物中,加入脱氧核糖核酸酶抑制剂和核糖核酸酶抑制剂孵育,收集磁珠,用含核糖核酸酶抑制剂的NT2 buffer洗涤磁珠,得到蛋白‑探针‑磁珠复合物;S5、RNP的收集:将步骤S4制得的蛋白‑探针‑磁珠复合物加入Urea CHAPS buffer孵育,去除磁珠,收集上清即得RNP。
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