枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）产生多种抗 菌次生代谢产物，被认为是具有潜在的、能有效抑 制病原菌并促进动植物生长的有益菌 ，具有很 高的农用及医用价值 。近年来，随着我国畜牧 养殖业不断发展，抗生素饲料添加剂造成的负面 影响严重影响了畜牧业的健康发展。抗菌脂肽作 为一种新型抗生素的替代品具有诸多优点，研发 和推广绿色、安全、健康、可持续养殖发展的抗生 素替代品已成为研究方向。

LB培养基、Landy培养基 、PDA培养基为 国产分析纯。

试验菌：4株枯草芽孢杆菌分别是GD株、SF-1 株、WT株和POC-4株，均分离自不同畜禽养殖场 周边环境土壤，由大连三仪生物工程研究所保存。 指示菌：致病性大肠杆菌 O2、金黄色葡萄球 菌（ATCC25923）、啤酒酵母菌（ATCC9763）、鸡白 痢沙门菌（CVCC2218）和桔青霉（AS3.2788）等标 准菌株，由中国微生物菌株保藏中心提供。

生物安全柜（Hfsafe-1800，上海力升科学仪器有限公司）；电热恒温培养箱（DNP-9022，上海精宏实验设备有限公司）；空气浴振荡培养箱 （HZQ-F160、HZQ-C，哈尔滨市东联电子技术开 发有限公司）；高速台式冷冻离心机（TGL-20M， 长沙湘仪离心机仪器有限公司）；旋涡混合器 （QL-866，江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公 司）；凝胶成像系统（UVPGDS-8000，美国 UVP 公司）；高效液相仪（DIONEX U3000，美国DION⁃ EX公司）；液质（LC-MS）联用仪Agilent 6540（QTOF LC/MS，美国安捷伦公司）；电热恒温鼓风干 燥箱（DGG-9240A，上海森信实验仪器有限公 司）；电子天平（BS210S，北京赛多利斯有限公 司）；精密 PH 计（PHS-3C，上海虹益仪器有限公 司）；显微镜（XSZ-4G，重庆光电仪器有限公司）； 双槽玻璃层析缸（薄层色谱展开槽/展开缸）（P1- 2020，上海楚定分析仪器有限公司）；全自动立式 电热压力蒸汽灭菌器（YXQ-LS-S2，上海博迅实业有限公司医疗设备厂）。

表面活性素（surfactin）（标准样品，美国Sigma 公司）；大孔树脂（XAD-16，上海宝曼生物科技有 限公司）；硅胶板（Silica Gel GF254 20 cm×5 cm， 上海科兴生物科技有限公司）；5%茚三酮溶液（乙 酸∶正丁醇=5∶95），乙酸、正丁醇、甲醇、无水乙 醇、盐酸、茚三酮等试剂（分析纯或色谱纯，国产）。

将各指示菌分别采用相应的固体平板培养基 进行复苏，37 ℃培养20 h（其中真菌采用28 ℃培 养36 h），再接种于装有50 mL LB培养液的250 mL 三角瓶，37 ℃、180 r/min培养20 h（其中真菌采用 28 ℃培养36 h），取出并通过平板计数法分别测定 指示菌数，并稀释至1×106 cfu/mL，4 ℃保存、备用。

将4株分离株枯草芽孢杆菌分别在LB平板上 活化，37 ℃培养20 h，分别取活化的单菌落转接于 装有50 mL LB培养液的250 mL三角瓶中，置37 ℃， 180 r/min，培养20 h。分别将各枯草芽孢杆菌再转 种到装有500 mL Landy培养液的3 000 mL三角瓶 中，接种量为5%，置32 ℃，180 r/min培养，备用。

取各分离株枯草芽孢杆菌24 h发酵液进行处 理，采用管碟法 ，对致病性大肠杆菌、沙门菌，金 黄色葡萄球菌、啤酒酵母菌、*等指示菌分别 抑菌效果检测，设 3 个重复，1 个培养基阴性对 照，1个阳性对照（革兰氏阳性菌采用*锌、 革兰氏阴性菌采用硫酸黏杆菌素、真菌采用两性 霉素，配置浓度参照中国药典规定配制），观测各 芽孢杆菌代谢产物的抑菌谱。

结果显示，不同分离株的枯草芽孢杆菌产生 的抑菌圈不同，同一分离株枯草芽孢杆菌对不同 指示菌的抑菌圈大小也不同；从抑菌圈来看，对真菌效果较好（20 mm左右），对革兰氏阳性葡萄球 菌抑菌效果明显（≥ 20 mm），好于革兰氏阴性菌抑 菌效果（D≈ 15~20 mm之间），其中分离株（GD）抑 菌圈达到20 mm，好于对照组。初步确 定GD株作为后续研究菌株。结果显示：硅胶板经过层析后，直接喷洒茚三 酮染色剂后加热，样品及标品表面活性素在相应 部位均没有显示，说明样品和标品中均没有游离 氨基酸存在，分子结构均为环状结构；采用浓HCl 进行原位水解后，在相应部位能见到标品及样品 的痕迹，再用茚三酮染色后，在对应位置处样品和 标品均能显色，说明样品和标品中已有游离氨基 酸存在，环状分子结构结构均已经打开。薄层板上样品与标品两个显色斑点所处的位置 比较表明，它们迁移的速度一致。初步判断该GD 株产生的抗菌产物与标品属于同一类脂肽化合物， 即表面活性素（urfactin）或表面活性素的同系物。

不同的芽孢杆菌产生的抗菌物质对不同指 示菌有不同的抑菌效果，对同种指示菌也有不 同的抑菌活性；同种芽孢杆菌产生的抗菌物质对不同指示菌有也有*不同的抑菌效果。根据研 究资料显示，枯草芽孢杆菌、淀粉液化芽孢杆菌 （B. amyloliquefaciens） 、短小芽孢杆菌（B. pum⁃ ilus） 、地衣芽孢杆菌（B. lichemformis） 、蜡样芽 孢杆菌（B. cereus）、苏芸金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis） 、类芽孢杆菌（Paenibacillus）和 环状芽孢杆菌（Bacillus circulan）等均能产生抗 菌物质，产生的抗菌物质是否类似、以哪一种为主 要组分，有待于进一步研究。

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