枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)产生多种抗 菌次生代谢产物,被认为是具有潜在的、能有效抑 制病原菌并促进动植物生长的有益菌 ,具有很 高的农用及医用价值 。近年来,随着我国畜牧 养殖业不断发展,抗生素饲料添加剂造成的负面 影响严重影响了畜牧业的健康发展。抗菌脂肽作 为一种新型抗生素的替代品具有诸多优点,研发 和推广绿色、安全、健康、可持续养殖发展的抗生 素替代品已成为研究方向。
LB培养基、Landy培养基 、PDA培养基为 国产分析纯。
试验菌:4株枯草芽孢杆菌分别是GD株、SF-1 株、WT株和POC-4株,均分离自不同畜禽养殖场 周边环境土壤,由大连三仪生物工程研究所保存。 指示菌:致病性大肠杆菌 O2、金黄色葡萄球 菌(ATCC25923)、啤酒酵母菌(ATCC9763)、鸡白 痢沙门菌(CVCC2218)和桔青霉(AS3.2788)等标 准菌株,由中国微生物菌株保藏中心提供。
生物安全柜(Hfsafe-1800,上海力升科学仪器有限公司);电热恒温培养箱(DNP-9022,上海精宏实验设备有限公司);空气浴振荡培养箱 (HZQ-F160、HZQ-C,哈尔滨市东联电子技术开 发有限公司);高速台式冷冻离心机(TGL-20M, 长沙湘仪离心机仪器有限公司);旋涡混合器 (QL-866,江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公 司);凝胶成像系统(UVPGDS-8000,美国 UVP 公司);高效液相仪(DIONEX U3000,美国DION⁃ EX公司);液质(LC-MS)联用仪Agilent 6540(QTOF LC/MS,美国安捷伦公司);电热恒温鼓风干 燥箱(DGG-9240A,上海森信实验仪器有限公 司);电子天平(BS210S,北京赛多利斯有限公 司);精密 PH 计(PHS-3C,上海虹益仪器有限公 司);显微镜(XSZ-4G,重庆光电仪器有限公司); 双槽玻璃层析缸(薄层色谱展开槽/展开缸)(P1- 2020,上海楚定分析仪器有限公司);全自动立式 电热压力蒸汽灭菌器(YXQ-LS-S2,上海博迅实业有限公司医疗设备厂)。
表面活性素(surfactin)(标准样品,美国Sigma 公司);大孔树脂(XAD-16,上海宝曼生物科技有 限公司);硅胶板(Silica Gel GF254 20 cm×5 cm, 上海科兴生物科技有限公司);5%茚三酮溶液(乙 酸∶正丁醇=5∶95),乙酸、正丁醇、甲醇、无水乙 醇、盐酸、茚三酮等试剂(分析纯或色谱纯,国产)。
将各指示菌分别采用相应的固体平板培养基 进行复苏,37 ℃培养20 h(其中真菌采用28 ℃培 养36 h),再接种于装有50 mL LB培养液的250 mL 三角瓶,37 ℃、180 r/min培养20 h(其中真菌采用 28 ℃培养36 h),取出并通过平板计数法分别测定 指示菌数,并稀释至1×106 cfu/mL,4 ℃保存、备用。
将4株分离株枯草芽孢杆菌分别在LB平板上 活化,37 ℃培养20 h,分别取活化的单菌落转接于 装有50 mL LB培养液的250 mL三角瓶中,置37 ℃, 180 r/min,培养20 h。分别将各枯草芽孢杆菌再转 种到装有500 mL Landy培养液的3 000 mL三角瓶 中,接种量为5%,置32 ℃,180 r/min培养,备用。
取各分离株枯草芽孢杆菌24 h发酵液进行处 理,采用管碟法 ,对致病性大肠杆菌、沙门菌,金 黄色葡萄球菌、啤酒酵母菌、*等指示菌分别 抑菌效果检测,设 3 个重复,1 个培养基阴性对 照,1个阳性对照(革兰氏阳性菌采用*锌、 革兰氏阴性菌采用硫酸黏杆菌素、真菌采用两性 霉素,配置浓度参照中国药典规定配制),观测各 芽孢杆菌代谢产物的抑菌谱。
结果显示,不同分离株的枯草芽孢杆菌产生 的抑菌圈不同,同一分离株枯草芽孢杆菌对不同 指示菌的抑菌圈大小也不同;从抑菌圈来看,对真菌效果较好(20 mm左右),对革兰氏阳性葡萄球 菌抑菌效果明显(≥ 20 mm),好于革兰氏阴性菌抑 菌效果(D≈ 15~20 mm之间),其中分离株(GD)抑 菌圈达到20 mm,好于对照组。初步确 定GD株作为后续研究菌株。结果显示:硅胶板经过层析后,直接喷洒茚三 酮染色剂后加热,样品及标品表面活性素在相应 部位均没有显示,说明样品和标品中均没有游离 氨基酸存在,分子结构均为环状结构;采用浓HCl 进行原位水解后,在相应部位能见到标品及样品 的痕迹,再用茚三酮染色后,在对应位置处样品和 标品均能显色,说明样品和标品中已有游离氨基 酸存在,环状分子结构结构均已经打开。薄层板上样品与标品两个显色斑点所处的位置 比较表明,它们迁移的速度一致。初步判断该GD 株产生的抗菌产物与标品属于同一类脂肽化合物, 即表面活性素(urfactin)或表面活性素的同系物。
不同的芽孢杆菌产生的抗菌物质对不同指 示菌有不同的抑菌效果,对同种指示菌也有不 同的抑菌活性;同种芽孢杆菌产生的抗菌物质对不同指示菌有也有*不同的抑菌效果。根据研 究资料显示,枯草芽孢杆菌、淀粉液化芽孢杆菌 (B. amyloliquefaciens) 、短小芽孢杆菌(B. pum⁃ ilus) 、地衣芽孢杆菌(B. lichemformis) 、蜡样芽 孢杆菌(B. cereus)、苏芸金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis) 、类芽孢杆菌(Paenibacillus)和 环状芽孢杆菌(Bacillus circulan)等均能产生抗 菌物质,产生的抗菌物质是否类似、以哪一种为主 要组分,有待于进一步研究。
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