HPLC流动相的注意事项

>> 流动相的作用
流动相具有运载样品分子的作用。
流动相还具有选择性分离的作用。
当固定相一定时，流动相的种类、配比和流动速度都严重影响分离效果。
>> 流动相的种类
液相色谱所用流动相根据分析目的可分为单一或混合流动相。
混合流动相还可分为比例固定和比例可变流动相。
梯度洗脱就是使用比例可变流动相。
>> 流动相使用的注意事项
流动相的级别
流动相的处理
——过滤和脱气
流动相的置换
>> 流动相的级别-水
水是见的极性溶剂
HPLC用水的要求：纯化水（重蒸水）


因为不纯物的存在，去离子水的吸光率较高。

纯化水中去除了无机和有机的污染物，因此吸光率降低。
>> 流动相的级别-有机试剂
采用“HPLC”级溶剂

溶剂级别
–HPLC级
–优级纯
–分析纯
1、都经过蒸馏和0.45um滤膜的过滤(除纤维毛、未溶解的机械颗粒等）。

2、优级纯的纯度比分析纯大,但里面含有极微量的防腐剂和抗氧化剂，这些添加剂往往有紫外吸收。

3、HPLC级经过0.2um滤膜的过滤,且除去有紫外吸收的杂质。
>> 分析纯级和HPLC级溶剂的吸光度比较图


>> 流动相的处理——过滤
•使用0.45um或更小孔径滤膜过滤，注意滤膜的种类。
•目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞管路和色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液时。
>> 滤膜类型

1、聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐。
2、醋酸纤维滤膜：不适用于有机溶剂，特别适用于水基溶剂。
3、尼龙66滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可以用于强酸，不适用于二甲基甲酰胺。
4、再生纤维素滤膜：蛋白吸收低，同样适用于水溶性样品和有机溶剂。
>> 过滤的注意事项
•不同的试剂分别过滤，过滤后再混合。
•注意滤膜的选择，不要混用。
•要现用现处理，尤其是水和缓冲液。
•要注意操作过程中的防尘。
•试样也必须过滤，可用一次性针头式过滤器。

>> 流动相的处理——脱气
•目的：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡。
•使用梯度洗脱时要有在线脱气装置。
•气泡对测定的影响：
1、造成压力波动，影响保留时间。
2、色谱柱中的气泡会造成峰变形。
3、检测池中的气泡会造成基线波动。
>> 脱气的方法
•1、超声波振荡脱气
•2、氦气置换清除法
•3、使用树脂膜的减压脱气法
•应根据实际的使用情况选择合适的脱气方法。单动相或配合好的混合流动相可以采用超声振荡脱气，梯度洗脱使用在线减压脱气。
>> 氦气置换清除法


>> 使用树脂膜的减压脱气法

>> 流动相的置换
•极性相似的试剂可以直接置换。
•极性不同的试剂，应用中间试剂作过渡。
例如：甲醇置换为正己烷时，可以考虑选择异丙醇作为中间试剂。
•缓冲液的置换应先用水冲洗，再用有机试剂置换水。直接使用有机试剂会造成盐的结晶，堵塞管路和色谱柱。