免疫组化（IHC）实验步骤是怎样的呢？

来源：北京百奥创新科技有限公司 2023年10月31日 10:01

做实验时最基础的就是深刻的铭记原理，如此在实验的实操阶段才能真正做到胸有成竹。简单来说，免疫组化就是一项利用抗原抗体反应来确定组织细胞内抗原和对蛋白定位、定性的实验技术。免疫组化（IHC）实验步骤是怎样的呢？一起来学习一下吧！

1.脱蜡与水化：将石蜡切片放置于60°烤箱烤片30-60min，这一步是为了使蜡片水分蒸发和石蜡融化，好让组织切片牢固地贴在玻片上。而后依次将其放入二甲苯I、II、III各10min，乙醇梯度（高至低：100%、95%、80%、70%）各2min，水洗5min（不要直接对着切片冲洗）。PBS洗3次，3 min/次。

2.细胞通透与封闭：用预热的封闭通透液（40ml PBS+120ul TritonX-100+400ul 30%H2O2）浸润切片30min（RT 避光），降低内源性过氧化物酶的活性。PBS洗3次，3 min/次。

3.抗原修复：由于制作石蜡切片时，甲醛固定使得蛋白之间交联及醛基的封闭作用从而失去抗原性，这一步就是让胞内的抗原决定簇重新“满血复活”。

比较常用的是微波修复，pH 6.0的0.01M柠檬酸钠缓冲液浸泡切片，在微波炉里高火4min至沸腾后，取出自然冷却至室温，重复2次，每次补足液体以免干片。（当然有的朋友用酶修复法也是可以的）。PBS洗3次，3 min/次。

4.血清封闭：用与二抗同一来源的血清封闭一些非特异性结合位点。此时可用油性笔围绕组织画圈，并对圈内的组织滴加稀释好的血清，37℃温箱中30min,用滤纸吸去多余的血清。

5.孵育一抗：对圈内的组织（面积为1×1）滴加稀释好的一抗20ul，4℃过夜或者37℃ 1-2h。PBS洗3次，3 min/次。（一般4℃过夜后，需要将切片放置37℃复温45min，防止脱片以及可使抗原抗体结合的更稳定）

6.孵育二抗：对圈内的组织（面积为1×1）滴加稀释好的二抗20ul，37℃ 1-2h，PBS洗3次，3 min/次。

7.切片显色：用DAB-H2O2显色10min，显色液最好是现用现配，此时要通过显微镜观察染色是否明显，10min内即可用蒸馏水终止显色。

8.复染及封片：为了形成细胞轮廓，更好的定位目标蛋白，可用Mayer苏木素染色30s，水洗，盐酸酒精分化2s，流水浸入15min。脱水时，乙醇梯度（由低至高：50%、70%、95%、100%）各2min。二甲苯5min使切片透明化，最后加入中性树胶封片（一般封片后最好立即拍照，若不能及时拍照，可用指甲油封固并保持好避光和湿度）。

以上就是关于免疫组化（IHC）实验步骤是怎样的问题解答，如果你想了解更多请咨询百奥创新客服哦~

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