产品推荐:水表|流量计|压力变送器|热电偶|液位计|冷热冲击试验箱|水质分析|光谱仪|试验机|试验箱


仪表网>技术中心>技术交流>正文

欢迎联系我

有什么可以帮您? 在线咨询

PCR反应条件分析

来源:上海抚生实业有限公司   2024年06月18日 13:12  

PCR 反应体系由反应缓冲液(10×PCR Buffer)、脱氧核苷三磷酸底物(dNTPmix)、耐热 DNA 聚合酶(Taq 酶)、寡聚核苷酸引物(Primer1Primer2)、靶序列(DNA 模板)五部分组成。各个组份都能影响 PCR 结果的好坏。PCR反应需要一定的条件才能完成,这些条件主要有以下方面:

一、缓冲液

任何一个生化反应都必须在一定的缓冲体系中进行,缓冲体系除了提供一定的pH缓冲能力外,还有一些有助于反应进行的成分。PCR反应缓冲液通常采用10 mmol/L Tris-HClpH 8.3-9.0,室温)缓冲液体系,其中含有可激活DNA聚合酶的活性中心的二价阳离子,一般采用Mg2+,以MgCl2的形式提供,Mg2+的浓度高低可显著影响 PCR扩增产物的特异性,此外,缓冲液中还含有50 mmol/LK+,有利于引物与模板的退火。有些缓冲液中还加入明胶或血清白蛋白(100 μg/mL)及去污剂(如Twcen20 等),对Taq DNA聚合酶起稳定作用。

二、模板

PCR模板是含有待扩增序列的 DNAmRNAcDNA等,模板数量可直接影响扩增的效果。对于一般的 PCR扩增,104107个模板分子可达到满意的效果,一般宜用纳克(ng)级的克隆DNA、微克(μg)水平的染色体DNA102105拷贝待扩增的DNA片段作为起始材料。除了数量外,模板的质量也非常重要,不能有太多的蛋白质和其他污染,特别是其他DNA的污染,即使是痕量的DNA,也会导致非特异性产物。

三、dNTP

dNTPdATPdTTPdGTPdCTP的总称。贮备液为pH 7.0 左右,其浓度一般为20 mmol-20℃保存。体系中为20~200 μmol即可,过低则反应速度下降,浓度过高则特异性下降,因为dNTP能络合溶液中的Mg2+,产生错配或抑制Taq DNA聚合酶活性。

四、耐热的DNA聚合酶

PCR反应中使用的 DNA聚合酶必须耐高温,在90℃以上的高温下仍能有活性,正是由于耐热DNA聚合酶的应用才使 PCR技术得以实现,目前使用的耐高温DNA聚合酶主要有Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶和Pwo DNA聚合酶等。

五、引物

PCR反应的最佳条件

根据大量的研究报道,PCR反应的最佳条件为:①Taq DNA聚合酶的浓度为1.0-2.5 U/100μL反应液;②dNTP的浓度为20200 μmol/L;③Mg2+浓度为0.52.5 mmol/L;④引物的浓度为0.21.0 μmol/L。在准备具体的PCR反应时,还要针对模板特性、PCR仪等进行上述反应体系的优化,并设置试验确定连退火温度、延伸时间,建立其相应的PCR反应优程序。



免责声明

  • 凡本网注明“来源:仪表网”的所有作品,均为浙江兴旺宝明通网络有限公司-仪表网合法拥有版权或有权使用的作品,未经本网授权不得转载、摘编或利用其它方式使用上述作品。已经本网授权使用作品的,应在授权范围内使用,并注明“来源:仪表网”。违反上述声明者,本网将追究其相关法律责任。
  • 本网转载并注明自其它来源(非仪表网)的作品,目的在于传递更多信息,并不代表本网赞同其观点或和对其真实性负责,不承担此类作品侵权行为的直接责任及连带责任。其他媒体、网站或个人从本网转载时,必须保留本网注明的作品第一来源,并自负版权等法律责任。
  • 如涉及作品内容、版权等问题,请在作品发表之日起一周内与本网联系,否则视为放弃相关权利。
联系我们

客服热线: 15024464426

加盟热线: 15024464426

媒体合作: 0571-87759945

投诉热线: 0571-87759942

关注我们
  • 下载仪表站APP

  • Ybzhan手机版

  • Ybzhan公众号

  • Ybzhan小程序

企业未开通此功能
详询客服 : 0571-87759942