客户文章|DAP-seq技术助力揭秘葡萄耐冷性的糖代谢调控机制

2025年4月8日，中国科学院武汉植物园辛海平研究员团队在Plant, Cell & Environment期刊(IF=6.1)上发表了题为“VaEIN3.1‐VaERF057‐VaFBA1 Module Positively Regulates Cold Tolerance by Accumulating Soluble Sugar in Grapevine”的研究论文，旨在揭示VaEIN3.1-VaERF057-VaFBA1模块如何通过调控可溶性糖积累增强葡萄耐冷性，为抗逆分子育种提供新靶点。该研究利用DAP-seq技术，筛选出了VaERF057的下游靶基因。

研究背景

葡萄作为低温敏感型经济作物，易受冷害影响产量与品质。植物耐冷性涉及渗透调节物质积累、抗氧化系统激活及激素信号调控，其中可溶性糖（如蔗糖、果糖）通过维持渗透平衡与能量供应发挥核心作用。乙烯信号通路关键转录因子EIN3/EIL家族和AP2/ERF家族成员（如ERF057）可协同调控逆境应答基因，但其在葡萄耐冷中的分子网络尚不明确。

技术路线

研究结果

本研究首先解析了葡萄转录因子VaERF057在冷胁迫响应中的功能。通过亚细胞定位证实VaERF057定位于细胞核，且其N端结构域（1-132氨基酸）具有转录激活活性。启动子-GUS实验结果表明低温处理显著增强VaERF057启动子活性，验证了其冷诱导特性。同时，检测转基因材料抗寒性指标，结果表明VaERF057过表达抗寒性显著提升。以上结果表明，VaERF057在葡萄冷胁迫下的具有积极作用。

图1. VaERF057是一种在细胞核中定位的冷诱导转录因子，具有转录激活活性。

图2. VaERF057在葡萄冷胁迫反应中的作用。

图3. 通过病毒诱导的基因沉默（VIGS）沉默VaERF057降低了葡萄叶的耐寒性。

为了探索VaERF057参与葡萄冷应激反应的潜在机制，通过联合分析DAP-seq和RNA-seq数据，在VaFBA1的启动子中发现了两个与VaERF057结合的顺式元件GCCCAC，并通过Y1H、EMSA和LUC验证了VaERF057与GCCCAC元件的相互作用。结果表明，VaERF057通过与GCCCAC元件的相互作用激活VaFBA1的表达。为进一步验证了VaFBA1基因功能，比较了冷处理条件下基因的表达水平，同时构建转基因材料检测耐寒性和糖代谢指标，结果表明，VaFBA1通过调节糖代谢在冷应激中发挥积极作用。

图4. VaERF057的顺式元件及其下游基因的鉴定。

图5. VaERF057通过调节VaFBA1参与糖代谢。

图6. VaFBA1在葡萄冷应激反应中的作用。

图7. 沉默VaFBA1可提高V. amurensis的冷敏感性。

进一步筛选了乙烯信号相关基因，通过外源乙烯（ACC）和乙烯抑制剂（AVG）处理，结合RNA-seq数据，发现一种冷诱导的转录因子VaEIN3.1可以与VaERF057的启动子结合，并通过Y1H、EMSA和LUC验证了VaEIN3.1可以结合到VaERF057的启动子并激活其表达。同时构建转基因材料，检测抗寒和糖代谢指标，结果表明VaEIN3.1在葡萄冷胁迫反应中的积极作用且当在葡萄叶片中敲低VaEIN3.1的表达时，VaERF057和VaFBA1的表达水平及糖含量均较低。以上结果支持了VaEIN3.1-VaERF057-VaFBA1模块通过调节可溶性糖含量来提高葡萄耐寒性的积极作用。

图8. VaEIN3.1与VaERF057启动子结合，正向调节其表达。

图9. VaEIN3.1通过调节VaERF057和VaFBA1参与糖代谢。

本研究发现，VaEIN3.1-VaERF057-VaFBA1模块通过级联调控增强耐冷性：VaEIN3.1激活下游VaERF057表达，后者直接结合糖代谢关键酶基因VaFBA1启动子，促进可溶性糖合成与积累，从而提升细胞渗透调节能力。该研究揭示乙烯信号与糖代谢通路协同抗冷的分子机制，为葡萄抗逆育种提供新靶点（如VaERF057和VaFBA1），并拓展了多基因模块设计育种的策略，对改良其他作物的耐冷性具有参考价值。

图10. VaEIN3.1-VaERF057-VaFBA1模块调节葡萄在冷胁迫下的可溶性糖含量。