小鼠原代胃Cajal间质细胞操作要点

小鼠原代胃Cajal间质细胞操作要点

培养条件优化

1. 培养基选择与补充： 建议使用DMEM/F12基础培养基，添加10%胎牛血清（FBS），1%双抗，以及以下关键生长因子：

干细胞因子（SCF，50ng/ml）： 促进ICC存活和增殖。

胰岛素样生长因子-1（IGF-1，25ng/ml）： 增强细胞代谢活性。

肝细胞生长因子（HGF，10ng/ml）： 维持ICC表型，抑制分化。

2. 培养环境： 将细胞置于37℃、5% CO2的恒温培养箱中，保持湿度饱和。由于ICC对氧化应激敏感，建议在培养箱中维持低氧条件（5% O2），以模拟其体内微环境。

3. 换液频率：换液应在接种后24小时进行，以去除未贴壁的细胞碎片。之后每2-3天换液一次，换液时保留约1/3旧培养基，以维持细胞分泌的自分泌因子。

细胞鉴定与功能检测

1. 免疫荧光鉴定：使用特异性抗体标记ICC的标志物，如c-Kit（CD117）、ANO1（TMEM16A）和vimentin。建议进行共标实验，例如c-Kit/ANO1双标，以提高鉴定准确性。

2. 电生理特性检测： 采用膜片钳技术记录ICC的自发电活动，观察其起搏电流（如：周期性内向电流）和慢波电位，这是ICC功能的重要指标。

3. 钙成像： 使用Fluo-4 AM等钙离子荧光探针，检测ICC内钙振荡的频率和幅度，评估其钙信号传导功能。

常见问题与解决方案

细胞贴壁率低：检查胶原蛋白包被是否均匀，尝试增加包被时间（4℃过夜）。亦可使用纤维连接蛋白（fibronectin）辅助包被。

细胞增殖缓慢： 确认生长因子活性，建议分装保存避免反复冻融。检查血清批次，必要时更换优质血清。

细胞表型丢失： 避免过度传代（建议P3以内），缩短消化时间，并定期进行免疫荧光鉴定。

注意事项

无菌操作： ICC培养对无菌要求高，所有操作需在超净台内完成，试剂需经0.22μm滤膜过滤。

轻柔操作： ICC细胞膜脆弱，吹打时避免产生气泡，建议使用宽口吸头。

数据记录： 详细记录细胞形态、增殖状态和实验参数，便于追溯问题。