详细介绍制备型液相色谱的工作流程

制备型液相色谱（PLC）的工作流程围绕 “高效分离、精准收集、高回收率” 核心目标设计，需经历 “样品预处理→系统准备→样品进样→色谱分离→馏分收集→后处理→系统清洗与维护”7 个关键环节。每个环节的操作细节直接决定最终产品的纯度、回收率及制备效率，实验室级与工业级 PLC 流程原理一致，但在设备规模、自动化程度上存在差异，以下结合共性逻辑与关键细节展开详细拆解。

一、环节 1：样品预处理 —— 为高效分离奠定基础

样品预处理是 PLC 流程的 “前置关键步骤”，核心目标是去除干扰杂质、调节样品状态，避免污染色谱柱、降低分离效率或影响目标物纯度。若预处理不充分，后续分离可能出现峰形异常、柱压升高、目标物纯度不达标等问题。

1.1 核心预处理操作（按流程顺序）

1.1.1 样品溶解与溶剂匹配

①　目的：将固体样品（如药物中间体、天然产物提取物）或半固体样品（如油脂、膏状物）溶解，确保样品与流动相兼容，避免进样后因溶剂极性差异导致峰形拖尾或溶质析出。

②　关键操作要点：

溶剂选择原则：优先使用 “初始流动相”（如反相 PLC 初始流动相为 “水 - 乙腈 = 90:10”，则用该比例溶剂溶解样品）；若初始流动相溶解度不足，可选择 “极性更弱的溶剂”（如反相中用纯水平衡，样品可用 50% 乙腈水溶液溶解，避免溶剂强度过高导致溶质提前洗脱）。

溶解度验证：通过超声（20-30 分钟）或温和搅拌辅助溶解，溶解后需目视确认无沉淀、无悬浮颗粒（若有不溶物，需后续过滤或离心去除）。

热敏性样品特殊处理：如蛋白质、多肽等热敏性样品，溶解时需控制温度（通常 < 30℃），避免加热导致变性。

1.1.2 过滤 / 离心除杂

①　目的：去除样品中的悬浮颗粒、不溶性杂质（如植物提取物中的纤维素、生物样品中的细胞碎片），避免堵塞色谱柱筛板（导致柱压骤升、固定相床层紊乱）或污染固定相。

②　关键操作要点：

滤膜选择：根据固定相粒径和溶剂类型选择滤膜 —— 制备柱固定相粒径为 5-20 μm 时，需用0.22 μm 或 0.45 μm滤膜；有机相样品（如正相 PLC）用尼龙膜或 PTFE 膜，水相样品用混合纤维素酯膜（避免水系滤膜在有机相中溶解）。

操作方式：

实验室级：用注射器手动过滤（单次处理 1-50 mL 样品），过滤前需用样品溶剂润洗滤膜（避免滤膜吸附目标物）；

工业级：采用在线过滤系统（与自动进样器联动），滤膜可定期更换，处理量可达数升 / 小时。

离心辅助：若样品含大量不溶物（如发酵液），需先高速离心（8000-12000 rpm，10-20 分钟），取上清液后再过滤，减少滤膜堵塞频率。

1.1.3 浓度调节与负载量匹配

①　目的：根据色谱柱 “最大负载量” 调整样品浓度，避免 “柱过载”（进样量过高导致峰形展宽、拖尾，甚至与杂质峰重叠）或 “欠载”（进样量过低导致制备效率低，溶剂浪费）。

②　关键操作要点：

负载量计算方法：通过 “线性放大法” 从分析型 HPLC 条件推导 ——

制备柱最大进样量 = 分析柱最佳进样量 × (制备柱内径 / 分析柱内径)²

（示例：分析柱内径 4.6 mm，最佳进样量 10 μg；制备柱内径 20 mm，最大进样量≈10 μg × (20/4.6)²≈186 μg）。

浓度调节：若样品浓度过高，用初始流动相稀释至 “进样体积 × 浓度≈最大负载量的 70%-80%”（留有余量，确保分离度）；若浓度过低，通过旋转蒸发浓缩（非热敏性样品）或冻干浓缩（热敏性样品）。

1.1.4 复杂样品预纯化（可选，针对高干扰样品）

①　适用场景：样品中含大量强保留杂质（如天然产物中的色素、油脂，生物样品中的杂蛋白），直接进样会污染色谱柱或增加分离难度（如杂质与固定相不可逆吸附，导致柱效下降）。

②　常用预纯化方法：

固相萃取（SPE）：用小规格 SPE 柱（如 C18 柱、离子交换柱）吸附目标物，先用弱洗脱溶剂去除杂质，再用强洗脱溶剂洗脱目标物，得到初步纯化的样品；

液液萃取：用与水不互溶的有机溶剂（如乙酸乙酯、正己烷）萃取目标物，去除水溶性或脂溶性杂质（如从植物水提液中用乙酸乙酯萃取黄酮类成分）；

蛋白沉淀：生物样品（如血清、发酵液）用硫酸铵等沉淀杂蛋白，离心后取上清液，避免杂蛋白堵塞色谱柱。

二、环节 2：PLC 系统准备 —— 确保设备稳定就绪

系统准备的核心是让泵、色谱柱、检测器、收集器处于 “洁净、平衡、校准” 状态，避免因流动相污染、柱平衡不足或信号漂移影响分离效果。实验室级与工业级系统准备流程类似，但工业级需额外关注溶剂储存与回收模块。

2.1 流动相配制与脱气

①　目的：提供高纯度、无气泡的流动相，确保泵流速稳定、检测器基线平稳，避免气泡导致的 “鬼峰” 或柱压波动。

②　关键操作要点：

流动相纯度要求：

溶剂：使用 HPLC 级或制备级溶剂（如甲醇、乙腈，纯度≥99.9%），水需为超纯水（电阻率≥18.2 MΩ・cm），避免溶剂中的杂质影响目标峰检测（如紫外吸收杂质导致基线漂移）；

缓冲盐：若流动相含缓冲盐（如磷酸二氢钾、三乙胺），需用超纯水全部溶解，并用 0.22 μm 滤膜过滤（避免盐颗粒堵塞泵单向阀或色谱柱），pH 值需精确调节（如反相 PLC 中 pH=2-7，避免硅胶固定相溶解）。

脱气操作：

实验室级：超声脱气（20-30 分钟，水温 < 40℃）或在线脱气机（插入流动相瓶，实时去除气泡）；

工业级：真空脱气系统（处理量可达数百升 / 小时），通过负压去除溶解氧和气泡，避免大规模制备中气泡累积。

2.2 色谱柱安装与平衡

①　目的：确保色谱柱连接正确、固定相床层稳定，且固定相与流动相达到 “分配平衡”，避免初始洗脱时峰形异常（如前沿峰、拖尾峰）。

②　关键操作要点：

色谱柱安装：

方向正确：色谱柱标签标注 “流向”（IN→OUT），需与流动相流向一致（反接会导致固定相床层松动，柱效下降）；

密封紧密：使用适配的 PEEK 接头或不锈钢接头，拧紧力度适中（避免漏液或损坏柱接口），实验室级柱压通常 < 400 bar，工业级 < 300 bar。

柱平衡流程：

等度洗脱：用初始流动相以 “50%-80% 工作流速” 冲洗色谱柱，冲洗体积为 10-20 个柱体积（如制备柱体积 50 mL，需冲洗 500-1000 mL），直至检测器基线平稳（UV 检测器基线漂移 < 0.1 mAU/h）；

梯度洗脱：先以初始流动相平衡 10 个柱体积，再运行 1-2 次 “空白梯度”（无样品进样），确认梯度切换时基线无剧烈波动（如无突升突降的 “梯度峰”）。

2.3 检测器与馏分收集器校准

①　目的：确保检测器信号准确、收集器动作与目标峰同步，避免因信号漂移导致目标峰误判或漏收。

②　关键操作要点：

检测器校准：

紫外检测器（UV）：用标准品（如对硝基苯胺，最大吸收波长 254 nm）验证波长准确性，并用不同浓度标准品绘制标准曲线，确保信号响应线性范围覆盖目标峰强度；

示差折光检测器（RID）：严格控温（±0.01℃），以流动相为空白校准基线，避免温度波动导致信号漂移（RID 对温度极敏感，0.1℃温差可导致 0.5 mAU 基线变化）；

蒸发光散射检测器（ELSD）：校准雾化气压力和漂移管温度，确保目标物响应稳定（无信号波动）。

馏分收集器校准：

时间校准：设定 “时间驱动模式”（如每 1 分钟收集 1 管），运行 10 分钟，验证收集时间误差 < 1 秒；

信号校准：注入少量目标物标准品（已知保留时间），观察收集器是否在标准品峰的 “起点 - 终点” 区间触发收集 —— 若标准品保留时间为 15 分钟，需确保收集器在 14.8-15.2 分钟启动并停止，偏差超过 0.1 分钟需调整信号阈值（如 UV 启动阈值从 0.3 mAU 改为 0.5 mAU）。

三、环节 3：样品进样 —— 精准引入样品至色谱柱

进样是 “将预处理后样品送入色谱柱” 的关键步骤，核心要求是 **“无歧视、无损失、重复性好”**，避免样品在进样过程中因扩散、残留或气泡导致分离效果下降。

3.1 进样方式分类（按自动化程度）

3.1.1 手动进样（实验室小批量制备，进样体积 1-50 mL）

①　设备：大体积手动进样阀（配备 1-50 mL 定量环）、玻璃注射器（体积略大于进样体积）。

②　操作步骤：

润洗进样系统：用样品溶液润洗注射器（3 次，每次润洗体积为注射器的 1/3）和定量环（通过进样阀 “LOAD” 模式注入样品，再排出，重复 2 次），避免残留溶剂稀释样品；

上样：将进样阀切换至 “LOAD” 模式，缓慢注入样品（速度 < 1 mL/s，避免产生气泡），注入体积需为定量环体积的 1.5-2 倍；

进样触发：排尽注射器内气泡，快速将进样阀切换至 “INJECT” 模式，同时在色谱工作站中启动数据采集（记录色谱图）；

进样后清洗：进样完成后，用初始流动相冲洗进样阀（通过 “LOAD” 模式注入流动相，重复 3 次），避免样品残留污染下一次进样。

3.1.2 自动进样（实验室大批量 / 工业级制备，进样体积 1 mL - 数 L）

①　设备：制备级自动进样器（兼容样品瓶、样品桶，支持连续进样），工业级还配备样品稀释、过滤一体化模块。

②　操作步骤：

样品装载：将预处理后的样品装入专用容器（实验室用棕色样品瓶避光，工业用不锈钢样品桶防腐蚀），放入进样器样品架，输入样品编号与体积；

参数设置：在工作站中设定进样参数 —— 进样体积、润洗次数（通常 3 次）、稀释比例（若样品浓度过高，自动用流动相稀释）、进样间隔（如前一批分离结束后 5 分钟自动进样）；

自动执行：启动进样程序，进样器自动完成 “吸样 - 排泡 - 注入 - 清洗” 全流程，无需人工干预；

异常监控：工业级系统配备压力传感器和液位传感器，若检测到进样压力异常（如堵塞）或样品不足，会自动报警并暂停运行。

3.2 进样量控制核心原则

单次进样量≤色谱柱最大负载量（避免过载），通常取最大负载量的 70%-80%（如最大负载量 100 mg，实际进样 70-80 mg）；

若样品中目标物含量低（如天然产物提取物中目标物含量 < 5%），可适当提高进样体积（但需确保总杂质负载量不超过柱容量，避免杂质污染固定相）。

四、环节 4：色谱分离 —— 目标物与杂质的核心分离过程

色谱分离是 PLC 的 “核心环节”，基于 “溶质在固定相和流动相之间的分配系数差异”，通过流动相带动样品流经固定相，使不同组分按保留时间差异先后洗脱，实现分离。此环节需实时监控色谱峰形与分离度，确保目标物与杂质全部分开。

4.1 洗脱方式执行（按样品复杂度选择）

4.1.1 等度洗脱（简单混合物分离，如二元混合物）

①　原理：流动相组成（如乙腈 - 水 = 30:70）始终不变，适用于目标物与杂质极性差异大、保留时间差异明显的样品。

②　操作要点：

监控重点：观察目标峰与相邻杂质峰的分离度（R），需满足 R≥1.5（全部分离），若 R<1.0，需调整流动相比例（如降低有机相比例，延长保留时间，提高分离度）；

示例：纯化某药物中间体（目标物 R=8 分钟，杂质 R=5 分钟），用乙腈 - 水 = 25:70 等度洗脱，分离度 R=2.0，满足要求。

4.1.2 梯度洗脱（复杂混合物分离，如天然产物、多组分药物）

①　原理：流动相组成随时间线性或阶梯式变化（如乙腈比例从 10% 线性提升至 90%，持续 30 分钟），通过逐渐增强流动相洗脱能力，使强保留杂质（如极性弱的组分）快速洗脱，避免峰形展宽或分离时间过长。

②　操作要点：

梯度参数优化：

初始比例：确保弱保留组分（早流出）有足够保留时间，避免与溶剂峰重叠（如反相 PLC 中，初始有机相比例通常 < 15%）；

梯度斜率：斜率越缓（如有机相比例每分钟提升 1%-2%），分离度越好，但分离时间越长；斜率过快（如每分钟提升 5%），易导致峰形重叠；

监控重点：观察梯度切换时的基线稳定性（无突峰）和目标峰的对称性（拖尾因子 T=0.9-1.2），若峰形拖尾，需调整流动相 pH 值。

4.2 实时监控与异常处理

①　实验室级：操作人员需实时观察色谱工作站谱图，若出现以下异常，需暂停进样并排查：

柱压骤升：可能是滤膜堵塞或色谱柱筛板堵塞，需更换滤膜或反冲色谱柱（低流速冲洗）；

峰形异常（分裂、拖尾）：可能是样品过载或流动相污染，需降低进样量或更换新配制的流动相；

基线漂移严重：可能是流动相未脱气或检测器温度波动，需重新脱气或校准检测器温度。

②　工业级：系统配备自动监控模块，若检测到柱压超过设定上限（如 400 bar）、目标峰纯度下降（通过在线 UV 光谱对比），会自动暂停运行并发送报警信号，需技术人员排查原因。

五、环节 5：馏分收集 —— 精准捕获目标物

馏分收集是 “从洗脱液中分离并收集目标物” 的核心步骤，直接决定目标物的回收率与纯度，需根据检测器信号精准截取目标峰，排除杂质峰（包括前杂质峰和后杂质峰）。

5.1 收集模式选择（按样品已知程度）

5.1.1 峰驱动收集（推荐，适用于已知保留时间的样品）

①　原理：根据检测器信号（如 UV 峰高、峰面积）自动判断目标峰的 “起点、顶点、终点”，仅在目标峰流出时收集，杂质峰流出时不收集，纯度更高。

②　关键参数设置：

启动阈值：设定信号超过某一值时开始收集（如目标峰基线噪音为 0.1 mAU，启动阈值设为 0.5 mAU，避免收集噪音）；

停止阈值：设定信号低于某一值时停止收集（如 0.1 mAU，确保收集完整目标峰）；

峰切割（可选）：若目标峰前有小杂质