制备型液相色谱的分离原理

制备型液相色谱（Preparative Liquid Chromatography, Prep-LC）是以获取高纯度、一定量目标化合物为核心目的的色谱技术，其分离原理与分析型液相色谱（Analytical LC）一致，均基于 “混合物中各组分与固定相、流动相之间作用力的差异”，实现组分在色谱柱内的迁移速度不同，最终达到分离效果。但制备型液相色谱在柱尺寸、样品负载量、分离目的上与分析型有显著区别（前者侧重 “制备”，后者侧重 “分析检测”），其分离原理可从核心机制、关键作用力、分离过程三方面详细解析。

一、核心分离机制：分配平衡与差速迁移

制备型液相色谱的本质是利用 “溶质（样品组分）在固定相（色谱柱内填充物）和流动相（携带样品的液体）之间的分配系数差异”，驱动各组分在色谱柱中以不同速度移动，从而实现分离。

分配平衡的定义

当样品被流动相带入色谱柱后，各组分将在固定相和流动相之间发生连续的溶解、吸附、解吸或离子交换等相互作用，并最终达到动态平衡。此时，组分在两相间的浓度比称为 “分配系数（K）”，公式为：

K = 组分在固定相中的浓度 / 组分在流动相中的浓度

差速迁移的结果

若某组分与固定相的作用力强（如吸附力、亲和力高），则其分配系数 K大—— 该组分更倾向于 “停留在固定相上”，随流动相向前迁移的速度慢。

若某组分与固定相的作用力弱（如吸附力、亲和力低），则其分配系数 K小—— 该组分更倾向于 “溶解在流动相中”，随流动相向前迁移的速度快。

最终，不同组分因迁移速度差异，在流经色谱柱后会先后从柱尾流出，通过检测器（如紫外检测器）识别后，收集目标组分的流出液，即可获得高纯度的制备样品。

二、关键作用力：基于固定相类型的分离模式

制备型液相色谱的分离效果直接依赖于 “固定相的选择”，不同固定相与组分的作用机制不同，形成了多种分离模式。其中，反相色谱（RP-HPLC）是制备型液相色谱中常用的模式，此外还有正相色谱、离子交换色谱、凝胶渗透色谱等，其核心作用力差异如下表所示：

1. 反相色谱

固定相特点：非极性（如 C18、C8 键合相）

流动相特点：极性（如水 - 甲醇、水 - 乙腈）

核心作用力：疏水作用（非极性组分与固定相间的疏水结合）

适用样品类型：极性较弱的有机物（如药物中间体、小分子化合物）

2. 正相色谱

固定相特点：极性（如硅胶、氨基键合相）

流动相特点：非极性（如正己烷 - 异丙醇）

核心作用力：极性作用（氢键、偶极 - 偶极作用）

适用样品类型：极性较强的有机物（如糖类、有机酸）

3. 离子交换色谱

固定相特点：带电荷基团（如磺酸基、季铵基）

流动相特点：缓冲液（如磷酸盐缓冲液）

核心作用力：离子键作用（样品离子与固定相电荷基团的静电吸引）

适用样品类型：离子型化合物（如氨基酸、蛋白质、核酸）

4. 凝胶渗透色谱

固定相特点：多孔凝胶（如聚苯乙烯凝胶）

流动相特点：与样品互溶的溶剂（如四氢呋喃）

核心作用力：体积排阻作用（小分子进入凝胶孔，迁移慢；大分子被排斥，迁移快）

适用样品类型：聚合物（如塑料、橡胶，用于分离不同分子量的聚合物）

三、完整分离过程（以反相制备型液相色谱为例）

制备型液相色谱的分离是一个 “样品加载→柱内分离→组分流出→目标收集” 的连续过程，具体步骤如下：

1. 样品预处理

制备前需对样品进行纯化（如过滤、萃取），去除杂质和不溶物，避免堵塞色谱柱；同时需将样品溶解在与流动相初始比例一致的溶剂中，减少 “溶剂效应”（避免样品与流动相极性差异过大导致的峰展宽）。

2. 样品加载

通过进样阀将大量样品（通常为毫克至克级，远高于分析型的微克级） 注入色谱柱顶端，样品被流动相（初始极性较高，如 90% 水 + 10% 乙腈）携带，进入填充有 C18 固定相的色谱柱。

柱内梯度洗脱与分离

启动梯度洗脱程序（逐渐提高流动相中有机相比例，如从 10% 乙腈升至 90% 乙腈）：

极性较强的杂质：与 C18 固定相疏水作用弱，分配系数 K 小，随初始流动相快速迁移，先流出色谱柱。

目标组分：与 C18 固定相疏水作用中等，随流动相极性降低（有机相比例升高），逐渐从固定相上解吸，以中等速度迁移。

极性较弱的杂质：与 C18 固定相疏水作用强，分配系数 K 大，需更高比例有机相才能解吸，最后流出色谱柱。

3. 组分检测与收集

流出液经过检测器（如紫外 - 可见检测器，根据目标组分的最大吸收波长设定检测波长，如 254nm），检测器将组分浓度信号转化为色谱峰（即 “制备色谱图”）。当目标组分的色谱峰开始出现时，启动收集装置（如自动馏分收集器），收集整个目标峰的流出液；当目标峰结束后，停止收集，避免混入相邻杂质峰。

后处理

收集到的目标组分溶液需通过旋转蒸发、冷冻干燥等方式去除流动相，最终得到高纯度（通常＞95%，甚至 99.9%）的固体或液体目标产物。