军团菌的取样、制样与检测方法！
军团菌的取样、制样与检测方法！
本标准描述了一种用于军团菌分离和估计环境样品中军团菌数量的培养方法。
该方法适用于所有环境样本，包括饮用水、工业用水和天然水以及沉淀物、沉积物和粘土/软泥等相关样本。
一、培养基和试剂
GVPC培养基、BCYE培养基(也可用硝酸铁琼脂代替)、酸处理缓冲液、BCYE-Cys(不含L-半*)
二、取样
1、取样容器
水样可采用玻璃、聚乙烯或类似容器。以前用过的容器应该清洗干净、扣干水分，121℃高压灭菌15min。如果容器不能经受高压灭菌，应在高于70℃的流动热水或流动蒸汽中处理至少5min。
2、含生物防腐剂的样品
如果水样中含有或被认为含有氧化型生物防腐剂，应在取样时或取样前加入非活性试剂加以中和。如果水样中含有消毒剂，需在采样前或采样后加入中和剂，含氯或氧化型消毒剂可用*或硫代硫酸钾作中和剂。
原则上讲，实验室接到水样后应尽快进行微生物学分析，是取样当天，尤其对于已知含生物防腐剂的样品。因此，建议从样品采集到制备好浓缩样的间隔为2d，不应超过5d，长不超过14d。
3、样品运输
样品应在6-18℃条件下被运输，应避免热和光照，在1d内，不超过2d将样品送到实验室。
三、制样
如果液体样品军团菌的数量估计超过105CFU/L，可以采用直接平板法，即直接涂布于GVPC平板。为了确保低于这个数量样品中军团菌的检测，需采用浓缩技术。为了浓缩水样，可采用膜过滤法或离心法。
1、膜过滤法
如果样品是浑浊的、乳浊的或有颜色的，应采用离心法。
采用膜过滤装置进行膜过滤，采用直径47-147mm，孔径0.22μm和0.45μm的膜。过滤后的膜应放置在带盖的无菌容器中，可用无菌剪刀剪碎，加5ml-25ml的无菌稀释液或无菌去离子水，不断摇动至少2min。也可将容器放入超声波中2-10min。
2、离心法
取200ml样品于300-500ml容积的离心瓶中，6000g离心10min或3000g离心30min，保持温度在15-25℃，弃去上清液，将沉淀物悬浮在2-20ml无菌稀释液或无菌去离子水中。
四、培养
1、将制备好的样品（浓缩的或未浓缩的）
分成3份，1份不做任何处理；1份进行热处理；1份进行酸处理。
2、热处理
加1±0.5ml样品于一无菌容器中，50±1℃水浴处理30±2min。
3、酸处理
加1-10ml样品于一拧盖的容器中，6000g离心10min或3000g离心30min，用无菌枪头吸去一半体积的上清液，通过涡旋重新悬浮剩余物，用酸处理缓冲液补足原始体积。混合静置5±0.5min。
4、选择性培养基的接种
分别接种未处理、热处理和酸处理的样品0.1-0.5ml于GVPC培养基上，热处理和酸处理的样品应在处理完立即接种，记录接种体积。
5、培养
翻转平板，36±1℃培养10d。
6、检查平板
在10d的培养期间，用显微镜在2-4d内至少观察3次，军团菌生长较慢，很可能被其他菌掩盖，记录每一种菌落形态的数量。
注：军团菌的菌落通常是白-灰-蓝-紫，但也可能出现棕色、粉色、灰绿色或深红色。军团菌表面光滑，边缘整齐，出现典型的毛玻璃现象。在紫外光下， L.bozemanii, L.gormanii, L.dumoffii, L.anisa, L.cherrii, L.steigerwaltii, L.gratiana, L.tucsonensis和L.parisiensis有亮白色荧光；L.rubrilucens 和L.erythra呈现红色；L.pneumophila菌落呈现暗绿色通常伴随有黄色。荧光的颜色有助于区分样品中军团菌的不同种。为了避免军团菌的死亡，不能将平板长时间暴露在紫外灯下。
五、可疑军团菌的确证
1、BCYE和其他培养基的二次培养
从每个GVPC平板上至少选择3个可疑军团菌菌落接种到BCYE和BCYE-Cys两块平板上进行二次培养，36±1℃培养至少2d。在BCYE上生长而在BCYE-Cys上不生长的被认为是军团菌。通过血清学实验（6.2）确证在BCYE上生长而在BCYE-Cys上不生长的菌落。
2、PCR及其相关技术：优点：有着更高的灵敏度和特异性，缺点：非特异性扩增 及交叉污染。
3、直接免疫荧光抗体法（DFA）：优点是简便、快速，缺点是敏感性低，且只能用于Lp的检测。
注：血琼脂和营养琼脂可以代替BCYE-Cys培养基。
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