NADP-苹果酸脱氢酶试剂盒的操作方法

NADP-苹果酸脱氢酶（NADP-malate dehydrogenase, NADP-MDH）

试剂盒说明书

测定意义：

MDH （EC 1.1.1.37）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，线粒体中MDH是TCA循环的关键酶之一，催化苹果酸形成草酰乙酸；相反，胞浆中MDH催化草酰乙酸形成苹果酸。草酰乙酸是重要的中间产物， 连接多条重要的代谢途径。因此，MDH在细胞多种生理活动中扮演着重要的角色，包括线粒体的能量代谢、 苹果酸-天冬氨酸穿梭系统、活性氧代谢和抗病性等。根据不同的辅酶特异性，MDH分为NAD-依赖的MDH和NADP-依赖的MDH， NADP-MDH主要存在于真核细胞中。

测定原理：

NADP-MDH催化NADPH还原草酰乙酸生成苹果酸，导致340nm处光吸收下降。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1 mL石英比色皿和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

试剂一、提取液60 mL×1瓶，在4℃保存；

试剂二、液体50 mL×1瓶，在4℃保存；

试剂三、粉剂×2支，-20℃保存；临用前加入300μL双蒸水，用不完的试剂仍-20℃保存；

试剂四、粉剂×2支，-20℃保存；临用前加入300μL双蒸水，用不完的试剂仍-20℃保存。

样本测定的准备：

1、 细菌、细胞或组织样品的制备 ： 

细菌或培养细胞：收集细菌或细胞到离心管内，弃上清，按照每200万细菌或细胞加入400μL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率20％，超声3s，间隔10s，重复30次），8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

组织：称取约0.1g组织，加入1mL试剂一进行冰浴匀浆；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2、血清（浆）样品：直接检测。

测定操作表：

将上述试剂按顺序加入1 mL石英比色皿中，混匀后在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种），340 nm波长下记录初始吸光度A1和反应1min后的吸光度A2，计算ΔA=A1-A2。

注意事项：

1、粗酶液的提取必须在0℃ - 4℃中操做完成，以防止酶变性失活。

2、实验时，试剂三、试剂四和样本在冰上放置，以免变性和失活。试剂二37℃或25℃室温放置。

NADP-MDH活力单位的计算：

1、血清（浆）NADP-MDH活力的计算

单位的定义：每升血清（浆）在反应体系中每分钟消耗1 μmol的NADPH定义为一个酶活力单位。 

NADP-MDH（U/L）=反应总体积（800μL）÷样本体积（20μL）÷反应时间(1min)÷NADPH消光系数（6.22×10-3）×ΔA= 6430 ×ΔA 

2、组织中NADP-MDH活力的计算:

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1 nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。

NADP-MDH（U/mg prot）=反应总体积（800μL）÷样本体积（20μL）÷反应时间(1min)÷NADPH消光系数（6.22×10-3）×ΔA÷蛋白浓度（mg/mL）= 6430 × ΔA ÷蛋白浓度（mg/mL）

（2）按样本鲜重计算：

单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟消耗1 nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。

NADP-MDH（U/g 鲜重）=反应总体积（800μL）÷样本体积（20μL）÷反应时间(1min)÷NADPH消光系数（6.22×10-3）×ΔA÷样本鲜重（g/mL）=6430 × ΔA ÷样本鲜重（g/mL）

3细菌或培养细胞中NADP-MDH活力的计算:

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟消耗1 nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。

NADP-MDH（U/mg prot）=反应总体积（800μL）÷样本体积（20μL）÷反应时间(1min)÷NADPH消光系数（6.22×10-3）×ΔA÷蛋白浓度（mg/mL）= 6430 × ΔA ÷蛋白浓度（mg/mL）

（2）按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟消耗1 nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。

NADP-MDH（U/104 cell）=反应总体积（800μL）÷样本体积（20μL）÷反应时间(1min)÷NADPH消光系数（6.22×10-3）×ΔA÷细菌或细胞密度（104/mL）=6430 × ΔA ÷细菌或细胞密度（104/mL）