V基因文库的装配和克隆

       为构建噬菌体抗体文库，无论是scFv模式或是Fab模式，VH基因都需要与VL基因并列到同一质粒中。虽然以下讨论特别涉及scFv构建，但其内容同样适用于Fab的构建。在每种情况下，两个V基因之间区域都起到将两者连为一体的作用。对于scFv片段，这个区域编码的是一段多肽接头，以此共价连接两个V基因。而对于Fab，此区域则是一段DNA，其中包括了1个核糖体结合位点和1个前导序列。
有3个连接VH和VL基因的基本方法：即PCR装配法（有关方案在本章提供）、序贯克隆法以及重组法。早期抗体文库的创建采用重叠延伸进行PCR拼接（装配）。而后来的抗体文库则是先构建单独的VM和VL文库，然后再用标准方法将任何一个文库克隆到另外一个文库中进行装配，或者用已克隆的材料进行PCR装配。
PCR装配法涉及两个或三个片段的剪接。在两个片段装配时，用互相重叠的引物扩增V基因，这样就可以通过PCR形成接头区域将二者剪接在一起。但这只在接头为非重复性时，才是可行的，因此，不适合使用scFv文库中常用的（Gly4Ser）3接头。这也同样不适用于Fab片段的装配，因为接头区过长就难以用两个引物重叠进行构建。当构建由Gly—Ser接头连接的scFv片段文库时，要么重叠区域必须能延伸至相对的一条链，要么接头必须先单独构建成一个片段文库，每种也都要与不同的VM和VL基因有同源性。这个接头再以三片段装配形式与VM和VL基因进行剪接。