在基于gⅥ的展示载体中克隆cDNA文库

1 ．利用PCR从预制的丸GTll文库中制备cDNA插入片段：pG6质粒是为带有多聚T核苷酸的cDNA进行方向性克隆而设计的。利用带有各自阅读框的三个载体，每个cDNA都有可能被正确翻译，直到核糖体遇到终止密码子。考虑到许多蛋白分子的装配，采用随机引物法来构建cDNA文库可能对克隆相互作用更适合。事实上，不是全长蛋白而是功能区，特别是细胞质的功能区对无毒性的及作为pⅥ融合的表达起着更重要的作用。然而，在理想条件下，在这些载体中对用随机引物法构建的cDNA文库进行克隆必须要求在每个载体的N021位点后，在每个阅读框内有翻译终止子的引导区。而且，只有50%的转化子在正确的表达位点上包含了cDNA 片段。

利用PCR从已制备的cDNA文库中制备大量的cDNA 片段，用来构建gⅥ-cDNA噬菌体颗粒文库。尽管描述了从一个已制备的、SfiI-NotIλ入GTll方向性克隆的cDNA文库中扩增的cDNA 片段，但是这更适合于从使用适当载体引物的其他文库中扩增cDNA 片段，这个引物包含了酶SfiI和酶NotI的限制位点。建立一个大容量的gⅥ-cDNA文库需要有十个同一的PCR反应。尽管提供一个特殊的方法很难，但从经验上来说，哺乳动物的cDNA文库由5×105～1×106个独立的克隆组成，从系统学上说，这些克隆至少包含每个mRNA的一个拷贝。模板cDNA文库应该如实地把序列、序列大小以及产生它的mRNA数量的复杂程度呈现出来，这是很重要的一面。为了增加DNA合成的保真度，我们*使用具有3’到5’核酸外切酶活性的DNA聚合酶。

扩增的DNA纯化后，用Sfi和NotI进行消化，除去小片段的cDNA，用0．8%（w/v）琼脂糖凝胶电泳来分离消化的cDNA 片段。另一方面，这些短的片段选择性地插入到文库中，并减少文库中长cDNA克隆基因的数量。从琼脂糖薄片上纯化DNA并借用商业可行的系统可以恢复和浓缩靶cDNA（大小在500～3000bp）。

2．连接与转化：扩增的cDNA 片段连接到pG6质粒上，为了确定优化条件，在脚注中描述了连接测试。另外，为了增加转化效率，建议纯化连接混合物。近年来，电转化法是将质粒DNA转化到大肠杆菌中有效的方法。

3．gⅥ-cDNA文库的评价及保存
为了确保在eDNA文库重建过程中筛选出来的阴性结果不是由技术失误造成的，因此检验文库的质量是十分有必要的，建议要决定好独立文库克隆的数量、片段基因克隆的比例、片段平均长度及它的长度范围。更加严格的质量控制的方法是随机抽取10个克隆，对每个cDNA片段从5’端至3’端测序，然后利用BLASTN数据库来分析获得的序列。