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使用*抗原来选择gⅥ-CDNA噬菌体文库

时间:2013-1-4阅读:443
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[方法]
1.在2m1的PBS2M缓冲液中打散2mg*磁珠(200ul)并在室温下旋转机中孵育l小时,再用PBST冲洗磁珠3次。
2.将2.5×1012TU的cDNA噬菌体文库(大概要准备250ml噬菌体文库)和用250ul PBS4M打散后的1mg磁珠混合,然后在室温旋转机中孵育l小时,这一步要尽可能多地除去与*结合的噬菌体颗粒。
3.用收集器收集磁珠,将上清液转移到新的微离心管中,加*诱饵(后浓度为250mmol/L)并在4℃旋转机中孵育3小时。
4.加1mg磁珠(*步准备好的)到噬菌体+诱饵混合物中并在4℃旋转机中孵育30分钟。
5.用收集器收集磁珠,用PBST冲洗磁珠10次,根据收集器将微离心机设置为瞬时离心以维持磁珠在微离心管的底部。
6.(a)在0.5ml的PBS和50mmol/L的DTT溶液中打散磁珠以便抽提噬菌体颗粒,在室温下孵育10分钟,然后用收集器收集磁珠并将上清液转移到一新的微离心管中,在冰浴中保存溶液。(b)另一方面,在400ul 0.1mol/L*—HCl,pH 2.2溶液中打散磁珠,再在室温下孵育10分钟,然后用收集器收集磁珠并将上清液转移到一新的微离心管中,加100ul 1mol/LTris—HClpH 8.0的溶液来中和该溶液,后在冰浴中保存溶液。7.将一半抽提出来的噬菌体(250ul)加10ml平板*0F细胞中⑧,在37℃孵育30分钟。
8.取一等份感受态培养细胞(100ul),连续稀释然后将它们涂抹在LBAT平板上,37℃过夜孵育后计克隆数。
9.在20℃,2500g旋转剩余的感受态培养细胞10分钟,除去上清液,然后在LBAT溶液中打散细胞颗粒,每一平方平板涂抹1m1细胞悬浮液,在37℃过夜孵育平板。
10.获得并储存选择出的克隆,如果还需做进一步的选择,可以在装有1 OD600细胞(8×108个细胞)的100m1摇瓶中接种20ml LBAT,并对噬菌体颗粒进行获取和纯化处理。

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