原代细胞悬液标本制备实验步骤

原代细胞悬液标本制备实验步骤

(1)取材：原代细胞收集对数生长期细胞于离心管中，800～1000r／min离心10min，弃上清，弹指法混匀细胞。沿管壁加入2．0％～2．5％冷戊二醛，轻轻吹打，4℃固定30min。用小铝片将细清。4℃PBS缓冲液冲洗1～2h或过夜，1000r／min离心5min，弃上清。

(2)制备预包埋块：管内加入2％～4％37℃琼脂糖液0．1～0．5ml，两手搓离心管，使细胞与琼脂糖混匀，室温冷却，形成细胞琼脂凝胶预包埋块。离心管内加适量PBs缓冲液或75％乙醇溶液，铝片沿管轻轻地将细胞琼脂糖凝胶块松动，预包埋块移入含75％乙醇溶液的青霉素瓶内，24h后换固定液一次，4℃保存，1年内使用。

(3)固定：预包埋块切成1mm3大小，置1％锇酸4℃固定1～2h。

(4)漂洗与脱水：PBS缓冲液反复漂洗30min或过夜。分别用50％、70％、90％、100％丙酮脱水各1次，每次10～15min；100％丙酮脱水3次，每次30min。

(5)浸透、包埋与聚合：浸入稀释包埋剂(丙酮：包埋剂为1：1)中，室温1h。再浸入纯包埋剂(如环氧树脂)中，37℃过夜。60℃固化48h。干燥器内保存备用。

(6)超薄切片：原代细胞首先将标本包埋块顶端修成近45。的四边锥体，使标本暴露出来，切面呈长宽约为0．4mm～0. 6mm的长方形或梯形。然后将其夹在标本夹中，固定在切片机上。玻璃切片刀需用胶布围成水槽，加入适量蒸馏水，使切下的薄片漂在水面，用覆有支持膜(透明塑胶膜)的载网(铜网或镍网)收集。可以根据薄片与水面反射光所产生的干涉色判断切片的厚度：以银白色(50～70nm)为；薄片大于l00nm(紫红色)，电子束的穿透较差，微细结构辨别不清；但小于40nm(暗灰色)图像反差低，难以观察。

(7)染色：在平皿中放一片蜡纸，并在其上滴1滴乙酸铀染液，用弯头小镊子夹住载网边缘，把贴有薄片的一面朝下，轻轻插入染液中，盖上平皿盖，室温下染色10～20min，双蒸水清洗2次；置人枸橼酸铅染液中染色15min，0. 1mol/L NaOH染液漂洗1～2s，双蒸水清洗2次。

(8)观察：原代细胞切片自然干燥后观察。