原代细胞传代培养法操作注意事项

原代细胞传代培养法操作注意事项

原理

原代细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时

也将细胞数量扩大，就必须进行传代(再培养)。 传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。

材料和试剂

1. 细胞：贴壁细胞株

2. 试剂：0.25%胰酶、1640培养基(含10%小牛血清)

3. 仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、培养瓶、吸管、废液缸等

原代细胞操作步骤

1. 吸除培养瓶内旧培养液。

2. 向瓶内加入胰蛋白酶和EDTA混合液少许，以能覆满瓶底为限。

3. 置温箱中2~5分钟，当发现细胞质回缩，细胞间隙增大后，立即终止消化。

4. 吸除消化液，向瓶内注入Hanks液数毫升，轻轻转动培养瓶，把残余消化液冲掉。注意加Hanks液冲洗细胞时，动作要轻，以免把已松动的细胞冲掉流失，如用胰蛋白酶液单独消化，吸除胰蛋白酶液后，可不用Hanks液冲洗，直接加入培养液。

5. 用吸管吸取营养液轻轻反复吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。

6. 计数板计数后，把细胞悬液分成等份分装入数个培养瓶中，置温箱中培养。

原代细胞无菌操作注意事项

1. 操作前要洗手，进入超净台后手要用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦试。试剂等瓶口也要擦试。

2. 点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧灼时间不能太长，以免退火，并冷却后才能夹取组织，吸取过营养液的用具不能再烧灼，以免烧焦形成碳膜。

3. 操作动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会。

4. 不能用手触已消毒器皿的工作部分，工作台面上用品要布局合理。

5. 瓶子开口后要尽量保持45℃斜位。

6. 吸溶液的吸管等不能混用。