原代细胞周期测定操作步骤

原代细胞周期测定操作步骤

 [实验器材]

1．仪器

原代细胞倒置显微镜，CO2培养箱，普通冰箱，超净工作台，低速冷冻离心机，显微数码摄影系统．水浴锅。

2．材料与试剂

(1)非无菌材料酒精棉球，离心管架，血细胞计数板，擦镜纸，记号笔，废液缸，甲醇·冰醋酸，Giemsa染液．秋水仙素，2×SSC液，30W紫外灯，水浴，饭盒。

(2)无菌材料和试剂辅料镊，6孔细胞培养板，培养瓶，15ml离心管，长丝滴管，10ml刻度移液管．灭菌塑料吸嘴，10％BS培养液，添加有0.02％EDTA的0.25％胰蛋白酶消化液．无菌Hank’s液，1.0mg／ml．BrdU溶液，1mol／L HCl溶液。

(3)细胞材料悬浮细胞培养物，贴壁细胞培养物。

[操作步骤]

1．取对数期生长的单细胞悬液，以一定密度接种在培养瓶或培养孔中。

2．当培养细胞进入对数生长期时，向培养液中加入BrdU，使Z终浓度为10μg／ml。

3．培养44~54h后，加入秋水仙素，终浓度为0.1μg／ml。

4．继续培养4~6h后，常规消化细胞至离心管中，原代细胞注意培养上清的漂浮细胞也要收集到离心管中。

5．常规染色体制片。

6．有细胞一面向下，将染色体玻片放在一饭盒中的玻璃支架上，加入2×SSC液以不超过标本表面为宜，然后在标本上覆盖一张擦镜纸，使纸的两边浸入2×SSC液中，以保持标本的湿润。

7．将饭盒放在56℃水浴锅中，湿育，上面用30W的紫外灯管6~10cm垂直照射30min。

8．弃去2×SSC液和擦镜纸，立即用4℃左右的流水冲洗。

9．Giemsa液染色5~10min，流水冲洗，干燥后镜检。

10．镜检100个细胞的分裂相，统计M1、M2、M3、M4细胞期(对应前期、中期、后期和末期这4个细胞分裂时期)分裂指数。

11．根据下式计算细胞周期

细胞周期(Tc)=48／[(Ml+2M2+3M3+4M4)／100](h)

[注意事项]

1．秋水仙素的加入时机会因细胞的类型、生长速度有所差异。

2．原代细胞加入BrdU后应避光培养。