T25m2 小鼠小肠平滑肌细胞提取物操作

注意事项：
1.接收到细胞，肉眼观察细胞培养基颜色
，显微镜观察细胞生长情况，并对细胞进行不同倍数拍照（建议收到时的培养瓶拍一张照片，显微镜拍收到时的细胞100X,200X各一张）。
2.用75%的酒精消毒（建议配置75%的酒精的水是灭菌过的）。
3.严格无菌操作，打开细胞培养瓶。
4.将细胞培养瓶内的培养基用吸管*吸出（严禁直接倾倒），放入另一无菌容器中（建议换新的培养基培养细胞）。
5.用PBS 2-3ml/次轻轻洗细胞表面，洗3-4次遍，加入0.05%胰酶-EDTA1-1.5ml,显微镜下观察细胞变圆，轻轻拍打培养瓶直到细胞脱落，加入终止液终止。
6.1000rpm，5min离心，重悬细胞。
7.换新的细胞培养瓶，37℃，5%CO2培养。

小鼠小肠平滑肌细胞提取物【Mouse Intestine: Normal Small Intestinal Smooth Muscle Cell Derivatives】小鼠小肠平滑肌细胞提取物是从小鼠小肠平滑肌细胞提取的，小鼠小肠平滑肌细胞从正常小鼠小肠组织制备。所有的产品在发货之前均经过严格的QA/QC流程以确保其质量。这些产品可以直接用于基因克隆，表达图谱分析以及各种分子生物学实验的研究。

总RNA制备：利用Qiagen RNeasy Kit的Trizol试剂分离RNA，然后用Qiagen RNA Clean Kit进行纯化。提供的总RNA样品附有RNA样品总浓度、总含量、电泳照片、OD值测定结果等。

cDNA制备：纯化后的总RNA来合成cDNA第一链，以50ul总反应体系进行逆转录，体系中包括MMLV反转录酶和随机引物以及10mg总RNA。68℃反应10min 后终止RT反应。利用1x RT Buffer 运输cDNA，1 ul cDNA 足够做一次PCR反应。所有cDNA产品在订单发货之前都经过了严格的QA/QC分析，保证了产品的质量。

蛋白制备：利用改良型RIPA Buffer (50mMTris, pH7.2, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 1% NP-40 , 1mM Na3VO4, 5mM NaF, 400uM PMSF, 1ug/ml of Pepstatin A, 5ug/ml of Aprotinin, 5ug/ml of Leupeptin)制备人关节软骨组织裂解液，离心去除组织碎片，通过Bio-Rad蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度，组织蛋白稀释后用非还原蛋白Buffer (50 mM Tris-HCl, pH 6.8, 5% Glycerol, 1% SDS, 0.002% Bromphenol Blue)添加5%β-巯基乙醇及PMSF，-80度保存。

潜在的应用： <1>已知基因的PCR克隆；<2>mRNA选择性剪接；<3>基因克隆与目标测序；<4> Western and Northern Blot；<5>蛋白检测与蛋白质组学；<6>芯片研究与表达图谱。该细胞只可用于科研，不得用于临床应用。
收到冻存细胞的处理方法：
1.37°C水浴预热培养基；
2.从液氮中取出细胞迅速放入37°C水浴快速解冻（解冻后不要继续暖细胞）；
3.在超净台中加入5ml培养基重悬细胞，1000rpm离心5min；
4.弃上清，加入5ml培养基重悬细胞后转入T25培养瓶中，轻轻晃匀；
5.置于37°C，5% CO2培养箱中培养(培养瓶盖没有透气孔的话，瓶盖不要拧太紧)；
6.第二天，用新鲜的培养基给细胞换液后继续培养。
实验要点及说明：
1．本方法适用于贴壁细胞培养，而不适用于悬浮细胞培养，悬浮细胞可使用滴片法； 
2．所使用的盖玻片应该为优质玻璃制造，并经过铬酸洗液处理； 
3．盖玻片非常薄，易碎，取放盖玻片时动作要轻； 
4．如果需要更多生长状态一致的细胞，可以使用较大的培养皿，但不宜过大，以避免培养液的浪费和增加污染机率； 
5．如果细胞贴壁生长能力较差，可将盖玻片在0.5%多聚赖氨酸溶液中浸泡5-10分钟并自然晾干。
实验报告：
一、分离与培养：
1、无菌条件下，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织，然后用PBS将此组织块清洗2次，将组织剪成1mm3左右大小；
2、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 胰酶和0.1% I型胶原酶），混悬10s，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置；
3、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液，混悬10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次，直至组织*被消化；
4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液，1200r/min 离心10min，弃去上清，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培养箱中培养；
5、差速贴壁1h后，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养；
二、免疫荧光鉴定：
1、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min；
2、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；
3、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在室温条件下，用4% BSA封闭细胞30min；
4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗，然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜；
5、PBS冲洗细胞3次，每次10min，按1：150的比例稀释抗α-actin的二抗， 37℃条件下放置1h；
6、用PBS冲洗3次，每次10min，在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照。
1158279-20-9  HLCL-61  25mg  Cochliomyia hominivorax嗜锥蝇探针法荧光定量PCR试剂盒 

1158279-20-9  HLCL-61  5mg  Mouse Pox Virus(MPV)鼠痘病毒探针法荧光定量PCR试剂盒 

1158-35-6  H-D-Lys(Z)-OMe . HCl  1g  Stenotrophomonas maltophilia嗜麦芽窄食单胞菌探针法荧光定量PCR试剂盒 

1158-35-6  H-D-Lys(Z)-OMe . HCl  25g  Ancylostoma duodenale十二指肠钩口线虫探针法荧光定量PCR试剂盒 

1158-35-6  H-D-Lys(Z)-OMe . HCl  5g  Stenotrophomonas maltophilia嗜麦芽窄食单胞菌探针法荧光定量PCR试剂盒
FIGF Protein Human 重组 VEGF-D / VEGFD / FIGF 蛋白 (His 标签)DL-半胱氨酸DL-Cysteine 质量规格：>97%,易氧化

小鼠神经质细胞(MN-sn)(1×106) T24, 膀胱癌细胞 HumanL-谷氨酰胺叔丁酯盐酸盐L-Glutamine t-butyl ester 质量规格：0.98

犬肾细胞;MDCK(NBL-2)L-谷氨酸-5-叔丁酯-1-甲酯盐酸盐L-Glutamic acid 5-tert-butyl 1-methyl ester  质量规格：>95%,BR

GAD2 Others Mouse 小鼠 GAD65 / GAD2 杆状病毒-昆虫细胞裂解液 (阳性对照) N-苄基甘氨酸盐酸盐Bzl-Gly-OH·HCl质量规格：0.98

皮肤肥大细胞Many types of cells包装：5 × 105方(1ml)甘氨酸苄酯盐酸盐Glycine benzyl ester 质量规格：0.98
小鼠小肠平滑肌细胞提取物操作非洲绿猴肾细胞系/HCV-E2;Vero-HCV-E2N-(1,3,4-Thiadiazolyl)烟酰胺质量规格：美国进口N-(1,3,4-Thiadiazolyl)nicotinamide

FN1 Others Human  Fibronectin / Fibronectin Fragme 2 细胞裂解液 (阳性对照) β-烟酰胺单核苷酸质量规格：美国进口β-Nicotinamide mononucleotide

615小鼠T细胞性白血病瘤株;L7712环丙孕酮质量规格：美国进口Cyproterone

MAP2K6 Others Human  MKK6 / MEK6 / MAP2K6 (207 Ser/Asp, 211 Thr/Asp) 杆状病毒-昆虫细胞裂解液 (阳性对照) 15β-羟基醋酸环丙孕酮质量规格：美国进口15β-Hydroxy Cyproterone Acetate

CM-M017小鼠胰腺导管上皮细胞*培养基100mL咽侧体抑制素Ⅳ质量规格：>95%,BRAllatostatin IV