原代兔支气管平滑肌细胞

细胞简介：

兔支气管平滑肌细胞分离自支气管组织；支气管（Bronchi），是指由支气管分出的各级分枝，由支气管分出的一级支气管，即左、右主支气管。左主支气管与右主支气管相比较，前者较细长，走向倾斜；后者较粗短，走向较前者略直，所以经支气管堕入的异物多进入右主支气管。支气管和支气管还有以区别就是，支气管是以“C”型的支气管软骨为支架，而支气管不是。支气管平滑肌细胞主要功能：①支气管平滑肌细胞能维持支气管张力，保持支气管形态；②支气管平滑肌特异的超微结构特点和调节机制是支气管正常生理功能的基础；③支气管平滑肌通过分泌细胞因子和趋化因子等促炎介质，发挥免疫调节功能。支气管平滑肌细胞原代分离培养3天后，可见细胞贴壁伸展，细胞形态：大小不一，呈梭形、不规则形、三角形或扇形，核卵圆形、居中；2周后细胞汇合，多数细胞伸展呈长梭形，胞浆丰富，有分枝状突起，细胞平行排列成单层或部分区域多层重叠生长，高低起伏；细胞密度低时，常交织成网状；密度高时，则排列为旋涡状或栅栏状。传代后细胞生长较快，4-6天即可汇合，并保持上述形态学特征和生长特点。
方法简介：

实验室分离的兔支气管平滑肌细胞采用YI蛋白酶-胶原酶联合消化法结合差速贴壁法制备而来，细胞总量约为5×10⁵cells/瓶。
质量检测：

实验室分离的兔支气管平滑肌细胞经α-SMA免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

1) 将5-10d的乳鼠浸泡入75%乙醇中，移入生物安全柜，

2) 从胸部解剖乳鼠，取出双肺置于预冷的PBS中，尽可能的除去结缔组织等，

3) 取肺边缘部分，剪碎，将组织块移入T25培养瓶中，倒置于细胞培养箱中，

4) 2h后，培养瓶中注入2 mL内皮培养基，小心将培养瓶正置于培养箱，确保组织块不会飘起来，

5) 每3d换液2mL，待细胞从组织块中爬出来后，隔2d换液，待细胞融合达到60-70%左右时，去除组织块，将肺微血管内皮细胞重新铺瓶。

1、您收到细胞后，请按照以下方法进行操作：

取出T-25cm2培养瓶，75%酒精擦拭培养瓶，拆下封口膜，放入37℃，5%CO2细胞培养箱中静置4-6小时或过夜，以稳定细胞状态，然后换用新鲜培养液继续培养或进行传代。

2、细胞传代：

1）细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时，弃25cm2培养瓶中的培养液，用PBS清洗细胞一次；

2）添加0.125%消化液约2ml至培养瓶中，倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后加入培养液终止消化，再轻轻吹打细胞使之脱落，然后将悬液转移至15ml离心管中，1500rpm/min，离心5min；

3）弃上清，沉淀细胞用12ml培养基重悬，然后按1:2比例进行分瓶传代，放入37℃，5%CO2细胞培养箱中培养；

4）待细胞贴壁后，观察培养结果，之后进行换液培养或传代。

3、细胞冻存：

1）细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时，弃25cm2培养瓶中的培养液，用PBS清洗细胞一次；

2）添加0.125%消化液约2ml至培养瓶中，倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后轻轻吹打细胞使之脱落，再加入培养液终止消化，然后将悬液转移至15ml离心管中，1500rpm/min，离心5min；

3）用适当量的冻存液（基础培养基：FBS：DMSO=7:2:1）重悬细胞，并放置于冻存管中；

4）先将细胞冻存管放置于-20℃ 1.5h，然后将其移入-80℃过夜，24h后转入液氮中进行长期保存。

4、细胞复苏：

1）从液氮中取出细胞冻存管（注意：佩戴防爆管面具）， 快速将其置入37℃水浴中解冻，直至冻存管中无结晶，然后用75%的酒精擦拭冻存管外壁；

2）将冻存管中的细胞移至15ml无菌离心管中，滴加入培养液5ml混匀细胞，然后将细胞悬液转移至适当面积大小的培养皿中；

3）放置于37℃，5%CO2细胞培养箱中培养；

4）第二天，换用新鲜培养基继续培养。