小鼠细胞实验分离和培养步骤

小鼠细胞实验分离和培养步骤:

1. 小鼠颈椎脱臼处死后，剃除腹胸部的被毛，放入装有75%酒精的烧杯中浸泡5min。

2. 取出小鼠，在无菌环境下打开胸腔，取出心脏组织，注入盛有无菌1×PBS的培养皿中，洗净组织表面的血液。

3. 将清洗干净的心脏组织转入装有75%酒精的培养皿中浸泡15s以杀死大多数的心脏被膜细胞，浸泡完成后立即转入装有无菌1×PBS的培养皿中震荡清洗。

4. 清洗完成后，用剪刀镊子配合除去主动脉弓和心房组织，仅保留心室部分，再次用1×PBS清洗去除心室内的血液。

5. 将清洗干净的心室组织用剪刀减成1mm3大小左右的碎块，之后用PBS清洗若干次后按下述两种方法之一进行后续操作。

A. 贴块法

6. 将清洗好的碎块转入另一培养皿中，用0.25%yi蛋白酶消化液浸泡组织，室温消化3-5 min。

7. 消化完成后，添加数毫升FBS终止消化，之后吸弃液体，加PBS清洗组织块1伺次后，用200 ul吸头将组织块平均接种于T-25培养瓶的培养面上，之后将培养瓶放置于37℃二氧化碳培养箱中，静置2-4h。

8. 待组织处于略微脱水的状态时，小心添加2ml培养基，添加时注意尽量不要将组织块冲起，要使培养基接触所有的组织块。

9. 之后放入培养箱中继续培养，一般2-4天后成纤维细胞会从组织块周围爬出，待爬出的细胞有较多数量时，可将细胞消化下来，去除组织块，转入另一培养瓶中培养。

B. 消化法

6. 将清洗好的碎块转入另一离心管中，加入混合消化液（0.08%yi酶+0.06%Ⅱ型胶原酶）37℃水浴消化8 min后，吸取上层混悬液弃去。

7. 余下组织加入混合消化液10 ml，37℃水浴震荡消化10 min；吸取上层悬液至另一离心管中，加入适量FBS终止反应；剩余沉淀物再加消化液消化3-5次，直至组织块消化。

8. 按1∶1加入含血清的培养基，中止酶反应，悬液过200目网筛去除较大的组织块。

9. 收集全部中止后的消化液于离心管中，300g，离心10 min，弃去上清，加入培养液重悬细胞后计活细胞数。

10. 调整细胞密度以1× 106个/ml 接种入的T-25培养瓶中，每瓶添加2 ml细胞悬液。

11. 培养瓶放置于37℃，5% 二氧化碳培养箱中静置40min后，吸弃上清液以去除未贴壁的非成纤维细胞和死细胞，再添加5 ml培养基继续培养。