免疫荧光试剂盒操作步骤

免疫荧光染色试剂盒(Immunol Fluorence Staining Kit)系列是Elabscience®开发的用于细胞或组织切片检测免疫荧光染色的试剂盒。在有适当的一抗检测特定的目标蛋白时，就可以使用免疫荧光染色试剂盒检测到红色、绿色或蓝色等荧光。

推荐Elabscience®的免疫荧光染色的试剂盒。

操作步骤：

1. 免疫荧光染色的准备工作

A.固定液的准备：

推荐使用4%多聚甲醛作为固定液(E-IR-R113)，或根据特定的一抗或样品采用有效成分为乙醇、甲醇或其它类型的固定液。

B.TBST工作液的准备：

推荐使用TBST作为洗涤液，可使用Elabscience®的10×TBST(E-BC-R335)，按照1:9的比例用去离子水稀释至1×的TBST工作液。

C.一抗稀释液的准备：

推荐使用Elabscience®的抗体稀释液(E-IR-R106)，也可选用PBS作为一抗稀释液。

D.一抗的稀释：

按照一抗说明书中推荐的用于免疫荧光染色的稀释比例用一抗稀释液稀释一抗。

E.荧光标记二抗的稀释：

推荐使用Elabscience®的抗体稀释液(E-IR-R106)，按照1:50的比例用将试剂盒中的免疫荧光染色二抗稀释成工作液，也可选用PBS作为抗体稀释液。根据荧光的强弱，稀释的比例可以适当提高或降低。

2. 对于贴壁细胞

A.  取普通洁净盖玻片于70%乙醇中浸泡5分钟或更长时间，无菌超净台内吹干或用细胞培养级PBS或0.9%NaCl等溶液洗涤三遍，再用细胞培养液洗涤一遍。将盖玻片置于六孔板内，种入细胞培养过夜，使约为50%-80%满。

B.  按照特定的实验目的处理细胞后，吸尽培养液，加入1 ml固定液，固定10分钟或更长时间(可4°C固定过夜)。

C.  去固定液，用TBST工作液洗3次，每次3~5分钟，吸尽液体。洗涤时宜用摇床，或手动晃动数次。

D.  用试剂盒中的正常山羊血清封闭液(E-IR-R110)封闭30分钟，可以在摇床上轻轻摇动。

E.  去除封闭液，用稀释的特定一抗湿盒内37°C避光孵育60分钟，可以在摇床上轻轻摇动。为增强与一抗的结合，可以4°C孵育过夜。

F.  去除一抗，用TBST工作液洗涤3~5次，每次3~5分钟。每次洗涤时都可以在摇床上轻轻摇动。

G.  去除TBST工作液，加入100 μL稀释好的荧光标记的二抗湿盒内37°C避光孵育60分钟。

H.  TBST工作液洗涤3~5次，每次3~5分钟，期间适当注意避光操作。

I.   复染核：滴加试剂盒中的DAPI染色液(E-IR-R103)避光孵育5 min，对标本进行染核，TBST工作液洗涤玻片5分钟，洗涤4次去除多余的DAPI染色液。

J.   滴一滴试剂盒提供的抗荧光淬灭封片液(E-IR-R119)于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，尽量避免气泡。使细胞接触封片液，切勿弄反。

K.   如果一抗选用适当，在荧光显微镜下可以观察到荧光。

3. 对于悬浮细胞

A.   离心收集细胞样品于1.5 ml离心管内，吸除上清后轻轻弹散细胞。

B.   加入0.5 ml固定液，缓缓悬起细胞，固定10分钟或更长时间(可4°C过夜)。

C.   离心去固定液，用TBST工作液洗3次，每次3~5分钟。洗涤期间可以用手或摇床轻轻晃动。

D.   最后一次离心后吸去大部分液体保留约50 μL液体，再缓缓悬起细胞，滴加至载玻片上，尽量使细胞分布均匀。

E.   稍晾干，使细胞贴在载玻片上不易随液体流动。如果条件许可，可以使用适当的离心机，通过离心把细胞贴紧在载玻片上。

F.   用试剂盒中的正常山羊血清封闭液(E-IR-R110)封闭30分钟。

G.   去封闭液，用稀释的特定一抗湿盒内37°C避光孵育60分钟。为增强与一抗的结合，可以4°C孵育过夜。

H.   去除一抗，用TBST工作液洗涤3~5次，每次3~5分钟。

I.    去除TBST工作液，加入100 μL稀释好的荧光标记的二抗湿盒内37°C避光孵育60分钟。

J.    TBST工作液洗涤3~5次，每次3~5分钟，期间适当注意避光操作。

K.   复染核：滴加试剂盒中的DAPI染色液(E-IR-R103)避光孵育5 min，对标本进行染核，TBST工作液洗涤玻片5分钟，洗涤4次去除多余的DAPI染色液。

L.    滴一滴试剂盒提供的抗荧光淬灭封片液(E-IR-R119)于载玻片上，盖上盖玻片，尽量避免气泡。

M.   如果一抗选用适当，在荧光显微镜下可以观察到荧光。

4. 对于组织切片

A.   对于石蜡切片，需先完成脱蜡、水化和抗原修复。对于冰冻切片可以直接按照下面的步骤操作。

B.   用固定液固定10分钟或更长时间(可4°C过夜)。

C.   去固定液，用TBST工作液洗3次，每次3~5分钟，吸尽液体。洗涤时宜用摇床，或手动晃动数次。

D.   用试剂盒中的正常山羊血清封闭液(E-IR-R110)封闭30分钟，可以在摇床上轻轻摇动。

E.   去除封闭液，用稀释的特定一抗湿盒内37°C孵育60分钟，可以在摇床上轻轻摇动。为增强与一抗的结合，可以4°C作用过夜。

F.   去除一抗，用TBST工作液洗涤3~5次，每次3~5分钟。每次洗涤时都可以在摇床上轻轻摇动。

G.   去除TBST工作液，加入100 μL稀释好的荧光标记的二抗湿盒内37°C避光孵育60分钟。

H.   TBST工作液洗涤3~5次，每次3~5分钟，期间适当注意避光操作。每次洗涤时都可以在摇床上轻轻摇动。

I.    复染核：滴加试剂盒中的DAPI染色液(E-IR-R103)避光孵育5 min，对标本进行染核，TBST工作液洗涤玻片5分钟，洗涤4次去除多余的DAPI染色液。

J. 滴一滴试剂盒提供的抗荧光淬灭封片液(E-IR-R119)于载玻片上，盖上盖玻片，尽量避免气泡。

K.   如果一抗选用适当，在荧光显微镜下可以观察到荧光。