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夹心 ELISA 测定两层抗体（捕获抗体和检测抗体）之间的抗原。目标抗原必须包含至少两个能够结合到抗体的抗原表位。单克隆或多克隆抗体均可在夹心 ELISA 系统中用作捕获抗体和检测抗体。单克隆抗体识别单一表位，可对抗原中微小差别进行定量检测。多克隆抗体通常用作捕获抗体以沉降尽可能多的抗原。夹心 ELISA 省去了分析之前的样品纯化步骤，而且提高了分析灵敏度（灵敏度比直接或间接 ELISA 高 2-5 倍）。
封闭和加样过程：
1. 每孔添加 200 μL 封闭缓冲液（5% 脱脂奶粉/PBS），封闭包被孔中剩余的蛋白质结合位点。
2. 用粘合塑料制品覆盖微量滴定板并在室温下孵育至少 1-2 小时，或在 4 ℃ 下孵育过夜。
3. 用 200 µL PBS 洗涤微量滴定板两次。
4. 每孔添加 100 μL 经过稀释的样品。通常将未知样品的信号与标准曲线的信号进行比较。每个板都必须测定标准品（两重测定或三重测定）和空白样。在 37 ℃ 下孵育 90 分钟。
确保标准品的浓度涵盖抗体结合的大部分动态检测范围。可能需要优化浓度范围以确保获得合适的标准曲线。样品和标准品通常采取两重测定或三重测定。
5. 弃去样品，用 200 μL PBS 洗涤微量滴定板两次。
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