双荧光素酶报告基因实验步骤

双荧光素酶报告基因实验（Dual-Luciferase Reporter Assay）是一种常用的分子生物学技术，用于研究基因表达调控、信号转导通路以及药物筛选。该实验利用了两个不同的荧光素酶报告基因：萤火虫荧光素酶（Firefly Luciferase，通常作为实验报告基因）和海肾荧光素酶（Renilla Luciferase，通常作为内参报告基因）。这两种荧光素酶具有不同的发光底物和发光光谱，可以在同一实验中独立测量其活性。

实验步骤：

构建报告基因载体：

将感兴趣的启动子或调控元件克隆到萤火虫荧光素酶基因（luc）上游，构建成实验报告基因载体。

将海肾荧光素酶基因（hRluc）构建到另一个载体中，通常与一个恒定表达的启动子（如SV40）连接，用作内参报告基因。

细胞转染：

将上述两个载体共同转染入细胞中。实验报告基因的表达水平将受到研究的启动子或调控元件的影响，而内参报告基因的表达水平相对恒定，用于校正转染效率和细胞活性。

细胞培养：

在特定条件下培养转染细胞，使其表达荧光素酶基因。

裂解细胞：

收集并裂解细胞，释放荧光素酶。

测定荧光素酶活性：

首先，加入萤火虫荧光素酶的底物（如荧光素），测定发光强度。萤火虫荧光素酶催化底物发生化学反应，发出绿色荧光，强度与萤火虫荧光素酶的活性成正比。

然后，加入海肾荧光素酶的底物（如共elenterazine），测定发光强度。海肾荧光素酶催化底物发出蓝色荧光，强度与海肾荧光素酶的活性成正比。

通过加入特定底物分别测定萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的发光强度。

数据分析：

计算萤火虫荧光素酶活性和海肾荧光素酶活性的比值（通常是萤火虫荧光素酶活性除以海肾荧光素酶活性）。这种比值可以校正转染效率和细胞数目差异，得到更为准确的实验结果。