EGFR抑制剂(Pelitinib)-上海抚生实业有限公司

货号	FS-X11062

培养操作步骤：

1．公司仅用于科研用盖片镊将盖玻片自75%乙醇中取出，用无菌丝绸布擦拭干净，不要用纱布；

2．将盖玻片轻轻放入6孔培养板（每孔一片）或培养皿中（每个平皿可放置2-3片）；

3．在距离紫外灯直射范围内20-30 厘米处照射2-3小时；

4．将经过计数的细胞悬浮液移入培养板中，使盖玻片*浸在培养液中；

5．将培养板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，当贴壁细胞生长至覆盖培养板底部2/3面积时，将培养板取出，用盖片镊轻轻取出盖玻片，用蒸馏水漂洗后即可进行快速固定以及免疫细胞化学检测。

中文名称：EGFR抑制剂(Pelitinib)

英文名称：Pelitinib

产品规格：1mL(10mM)|5mg|10mg|25mg|50mg|100mg

货号：FS-X11062

产品介绍:

Pelitinib(EKB-569;WAY-EKB569)是可逆的EGFR抑制剂，IC50值为38.5nM。也可轻微抑制Src，MEK/ERK和ErbB2，IC50值分别为282，800，和1255nM。

注：本品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他用途！

号：257933-82-7

别名：EKB-569;WAY-EKB 569

纯度：98.65%

分子量：467.92

储存条件：-20℃，有效期2年，溶入溶剂后-20℃请尽量在一个月内使用。

实验报告：

一、分离与培养：

1、无菌条件下，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织，然后用PBS将此组织块清洗2次，最后将组织剪成1mm3左右大小；

2、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型胶原酶），混悬10s，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置；

3、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液，混悬10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次，直至组织*被消化；

4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液，1200r/min 离心10min，弃去上清，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培养箱中培养；

5、差速贴壁1h后，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养；

二、免疫荧光鉴定：

1、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min；

2、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在室温条件下，用4% BSA封闭细胞30min；

4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗，然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜；

5、PBS冲洗细胞3次，每次10min，按1：150的比例稀释抗α-actin的二抗， 37℃条件下放置1h；

6、用PBS冲洗3次，每次10min，最后在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照。

扭转蛋白B抗体 Torsin B

转录延伸调节蛋白1抗体 TCERG1

巴尔得-别德尔综合征相关蛋白8抗体 TTC8

味觉受体蛋白家族2亚基7抗体 TAS2R7

味觉受体蛋白家族2亚基50抗体 T2R50

扭转原肠胚形成同源蛋白1抗体 TWSG1

Tuftsin蛋白抗体 Tuftsin

跨膜蛋白161A抗体 TMEM161A

肿瘤坏死因子α诱导蛋白8抗体 TNFAIP8

TBC结构域TBCD4蛋白抗体 TBCD4

宫颈癌原癌基因8抗体 TTC23

肿瘤坏死因子受体相互作用蛋白抗体 TRIP
EGFR抑制剂(Pelitinib)暗鳞白鬼伞 Oleoside

多源中间根瘤 Raucaffricine

猪丹丝 Ohchinin

灰树花GF-5 O-Demethylforbexanthone

林生毛霉 Obtucarbamate A

佐氏库特氏 Protoplumericin A

枯草芽孢杆 Oblongine

施氏假单胞 Ocotillone

短双歧杆 Nigrolineaxanthone V

变幻青霉（可订）蕊木碱甲酯

尖孢镰孢辛夷烯酮

大单孢属 Borapetoside B

白腐盾壳霉（葡萄白腐病）紫背金牛

水牺黄杆 Aglaxiflorin D

Chryseobacterium 粗毛羊藿
操作规程

1、在96孔板加入细胞100μL/孔，通常细胞增殖实验每孔加入100微升2000个细胞，细胞毒性实验每孔加入100微升5000～10000个细胞（具体每孔所用的细胞的数目，需根据细胞的大小，细胞增殖速度的快慢等决定）。置37℃ 5%CO2细胞培养箱培养24小时.

2、.加入适当浓度的0～10μL 受试化合物。

3、将96孔板在37℃，含5% CO2空气及100%湿度的细胞培养箱中孵育适当时间。

4、将5×MTT 用稀释液稀释成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小时，使MTT 还原为甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板摇床摇匀。

7、酶标仪在570nm 波长处检测每孔的光密度（如无570nm 滤光片，可以使用560-600nm 的滤光片）。

8、结果分析

a、细胞的存活率：将各测试孔的OD 值减去本底OD 值（*培养基加MTT，无细胞）或空白药物孔OD 值（*培养基加受试药物的不同稀释度加MTT，无细胞），各重复孔的OD 值取平均数±SD。细胞的存活率以T/C%表示，T 为加药细胞的OD 值，C 为对照细胞的OD 值。细胞存活率% =（加药细胞OD/对照细胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 时的药物浓度(IC50)及T/C = 10%时的药物浓度(IC90)