当寻找适用的方法时，请注意下述资料是10多年经验的结晶。
制备1升Bouin固定液：2g苦味酸溶于500ml去离子水中，滤过，在通风橱中，加入20g多聚甲醛，加热至60℃，加数滴lmol／LNaOH使其溶解；冷却，加500ml 2xPBS。
大多数的组织学研究都采用多聚甲醛固定、石蜡包埋的组织标本。因此，此类来源的大多数的组织和器官，对抗原的定位可直接提供可靠的资料。组织学家和病理学家有丰富的组织学经验，并且，对抗原表达模式的评价是很有价值的。
如果固定和包埋过程粗糙，则许多抗原不能被很好地保存。固定的持续时间是一个很重要的可变因素，因为延长固定时间会降低抗体反应能力。在病理学实验室，固定的持续时间和其他细节也很少规范化。因为固定液对组织的穿透率在特定温度下是恒定的（大约室温下imm／h），所以，不可能将所有样品用相同的方式固定。因免疫染色的目的不同，固定方法应各异。理想的设计是研究者能够将标本的收集、固定专门化，在研究中优化设计，从而能够更好地证实抗原。
避免使用含有汞的固定液。
1．准备工作
石蜡组织块可以事先准备，切片可以在步骤5中完成。许多病理学或其他相关实验室有大量贮存的研究材料。
2．需要的溶液和特殊设备
4％多聚甲醛（新鲜配制，见附录Ⅳ）或Bouin固定液，详见步骤2；
二甲苯、100％乙醇和95％乙醇；
切片机，石蜡包埋设备。
3．操作步骤
（1）将组织切成小块约lcm×lcm×0．4cm。
Methocarn是甲醇：氯仿：冰乙酸按6：3：1的比例配制的混合物。当使用Methocarn时，切片的*步必须使用无水乙醇。
（2）将组织块放入固定液中，如果标本制备专为进行免疫化学定位研究，包括直接染色或者对比染色、复染，建议使用新鲜配制的4％多聚甲醛。然而，标准的病理学方法可以有效地使用任何一种广泛适用的固定液，包括Bouin液或Methocarn。
固定液穿透组织大约每小时imm。可以由此估计判定所需要的固定时间。
（3）标本孵育2h至过夜。
（4）标准的石蜡包埋过程和组织切片。
（5）收集4um切片，粘于干净的载玻片上。
石蜡组织块在步骤4常可贮存，供以后检测。石蜡组织块较稳定，可以使用多年。
（6）标本片于37℃孵育过夜。
高温（步骤6）常常在许多组织化学过程中被采用，但是常会引起许多抗原表位的缺失，所以应尽可能避免。
（7）切片用二甲苯脱蜡，换2次，每次3min。
（8）用系列乙醇水化（100％乙醇，换2次，每次3min；95％乙醇，换2次，每次3min。
（9）用水漂洗。
由于固定、包埋和准备条件粗糙，石蜡包埋组织切片的染色常要求敏感的检测方法和应用多步骤放大效应技术。
此时，标本可进行抗体染色
4．常见的问题
如果使用过氧化物酶或者碱性磷酸酶标记的检测方法，在加入抗体前如果需要阻断内源性酶的活性，则标本应该先阻断或抑制内源性酶的活性。由于阻断过程也许会损伤一些抗原，所以不如改用检测试剂。
阻断内源性过氧化物酶的活性，使用甲醇：3％过氧化氢（按4：1的比例配制）溶液孵育标本20min。过氧化氢一般以30％的溶液贮存于4℃，可以存放1个月。有些标本如睥或骨髓具有较高过氧化氢酶活性，则采用0．1％盐酸苯肼／PBS溶液会取得较好的效果。尽管有些资料建议单纯使用3％过氧化氢处理标本，但是不应该这样做，因为剧烈的反应和气泡的形成可以破坏标本。
阻断内源性碱性磷酸酶活性，则用0．1 mm01／L左旋咪唑溶液孵育。此抑制剂不能减少肠组织的碱性磷酸酶活性。因此，碱性磷酸酶标记的抗体不宜用于有内源性肠碱性磷酸酶的标本染色。
