（1）样品洗毕，重悬于含1％正常羊IgG的PBS中。在1．5m1锥形管中胚胎或其他样品所占体积应少于50fJl，或在5mlsnap-top管中应少于200fil。摇动孵育1h。
在此方法中，以非免疫动物的羊IgG作为封闭剂，即从正常羊血清中通过蛋白G纯化制备。因本文推荐的标记二抗是羊抗鼠（或兔）免疫球蛋白抗体，故选择羊IgG作为封闭试剂。如使用的是另一来源的标记二级试剂，则应改用其他封闭剂，如可选用3％牛血清白蛋白。
（2）用PBS洗样品2次。
（3）加一抗：用含蛋白质的溶液进行抗体稀释。例如，用含1％正常羊IgG的PBS。
单克隆抗体选用杂交瘤细胞培养上清（特异性抗体浓度为20-50us／mi；以1：10稀释度作起点为佳）。小鼠腹水，纯化的单克隆抗体和多克隆抗体以及粗制的多克隆抗血清应测试一定范围内的稀释度，从而使特异性抗体浓度达到o．01～1Ps／ml。如果特异性抗体浓度是未知的，制备并测试初始制品的不同稀释度（1：10，1：100，1：1000和1：10 000）。
在果蝇类标本的抗原分析中常使用双标记方法，详见第五章。异硫氰酸荧光素（FITC）和德克萨斯红（Texas red）是一对很好的试剂，由于FITC标记抗体所发出的荧光更强，因而可用来染色较难检测的抗原。
（4）在4℃孵育样品24h。
（5）用PBS洗样品3次，每次5min以上。该缓冲液中可含1％TritonX—100或NP-40，以降低背景。
（6）加荧光染料标记的二抗试剂：用含蛋白质的溶液如1％正常羊IgG／PBS制备各种稀释度。常用的二抗试剂包括抗免疫球蛋白抗体、蛋白A和蛋白G。一般而言，建议使用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠（或兔）免疫球蛋白二抗。标记的二抗可以购自供应商，如果使用商业来源的标记二级试剂，其稀释度可从1：50至1：1000。碱性磷酸酶标记的试剂应用Tris缓冲液稀释，而不用PBS。
（7）与标记的二抗试剂在4℃孵育至少1h。
（8）用PBS洗样品3次，每次5min。该缓冲液中可以含1％TritonX-100或NP-40，以降低背景。
（9）优化选择：当在高倍镜下观察胚胎时，胚胎的直观视觉模式和通过胚胎的光路长度常引起样品出现不透明的现象。为了克服这一特点，通常用不同的试剂处理胚胎，这样可改变胚胎的折射指数。可将胚胎在甘油或甲基水杨酸盐溶液中孵育。对于大多数染色标本而言，甘油效果较好。
将胚胎重悬于500u1的甘油／PBS（50：50）混合液中，于室温下孵育1h。
离心胚胎，重悬于70：30的甘油／PBS混合液中。
经过甲基水杨酸盐溶液处理的标本清晰度比甘油更好，但其易挥发，使一些工作者难于忍受这种气味。此外，它没有黏度，使得对胚胎的处理容易。可先将胚胎通过一系列乙醇处理：50％乙醇5min，70％乙醇5 min，90％乙醇5 min，100％乙醇5 min，各2次。加500~1甲基水杨酸盐溶液，作用10 mm，不要摇动试管。胚胎将沉到底部。去除上清并加新鲜的甲基水杨酸盐溶液。后用甘油代替甲基水杨酸盐溶液。
（10）使用共聚焦显微镜观察并记录图像。为了正确使用该仪器，工作者应参考这一特殊仪器的使用说明。关于共聚焦显微镜的一般性讨论，参见Spector等（1998）。
