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聚合酶链式反应(PCR)操作步骤

时间:2024/8/5阅读:769
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聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,为常用的分子生物学技术之一。操作步骤:
1.在冰浴中,按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
10×PCR buffer 5 μl
dNTP mix (2mM) 4 μl
  引物1(10pM) 2 μl
 引物2(10pM) 2 μl
Taq酶 (2U/μl) 1 μl
DNA模板(50ng-1μg/μl)  1 μl
加ddH2O至 50 μl
视PCR仪有无热盖,不加或添加石蜡油。
2. 调整好反应程序。将上述混合液稍加离心,立即置PCR仪上,执行扩增。一般:在93℃预变性3-5min,进入循环扩增阶段:93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,循环30-35次,最后在72℃ 保温7min。
3. 结束反应,PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。
4.PCR的电泳检测:如在反应管中加有石蜡油,需用100μl氯仿进行抽提反应混合液,以除去石蜡油;否则,直接取5-10μl电泳检测。

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