实时荧光定量PCR（qPCR）技术简介

荧光定量PCR也叫Real-Time PCR，是美国PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术。荧光定量PCR的发展史是一部ABI、罗氏和伯乐等的荡气回肠的斗争史，感兴趣的可以去查查。该技术是目前成熟，使用广泛的半定量PCR技术。

荧光染料法（SYBR Green I）：

SYBR Green I是荧光定量PCR常用的DNA结合染料，与双链DNA非特异性结合。在游离状态下，SYBR Green 发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合，其荧光增加1000倍。所以，一个反应发出的全部荧光信号与出现的双链DNA量呈比列，且会随扩增产物的增加而增加。由于染料是与双链DNA的非特异性结合，因此可能产生假阳性的结果。

荧光探针法（Taqman 技术）：

PCR扩增时，加入一对引物的同时再加入一个特异性的荧光探针。该探针为一直线型的寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，检测不到荧光信号；PCR扩增时（在延伸阶段），Taq 酶的 5' —— 3' 切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成全同步。临床检测中Taqman探针法是常用的检测方法。