聚合酶链反应(PCR)技术循环参数分析

       聚合酶链反应(PCR)技术是在体外进行的由引物介导的酶促DNA扩增反应。PCR的原理是在模板DNA、PCR引物、四种脱氧核糖核苷酸(dNTP)及适当浓度的Mg2+存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的体外酶促合成反应。两个引物分别位于靶序列两端，同两条模板的3’端互补，由此限定扩增片段。PCR反应由一系列的变性→退火→延伸反复循环构成，即在高温下模板双链DNA变性解链，然后在较低温度下同过量引物退火，再在适中温度下由DNA聚合酶催化进行延伸。理论上，经过N次循环可使特定片段扩增到2n-1，考虑到扩增效率达不到100%，所以通常经25到30次循环可扩增到106倍，足够后续实验展开。

1.预变性

模板DNA全变性与PCR酶的全激活对PCR能否成功至关重要，建议加热时间参考试剂说明书，一般未修饰的Taq酶激活时间为两分钟。

2.变性步骤

循环中一般95℃，30秒足以使各种靶DNA序列全变性，可能的情况下可缩短该步骤时间。变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻di，易造成扩增失败。

3.引物退火

退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的Tm值为参考，根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。退火温度对PCR的特异性有较大影响。

4.引物延伸

引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）。但在扩增长度较短且退火温度较高时，本步骤可省略延伸时间随扩增片段长短而定，一般推荐在1000bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生设定为1min/kbp。

5.循环数

大多数PCR含25-35循环，过多易产生非特异扩增。

6.最后延伸

在最后一个循环后，反应在72℃维持10-30分钟．使引物延伸全，并使单链产物退火成双链。