PCR实验标准操作规范

PCR实验，全称聚合酶链式反应实验，是一种在体外快速扩增特定DNA片段的分子生物学技术。该技术通过模拟DNA天然复制过程，利用引物、DNA聚合酶和脱氧核苷酸（dNTP）实现目标序列的指数级扩增。其核心原理基于DNA双链的变性、引物的退火结合以及DNA聚合酶的延伸合成三个步骤的循环重复。

1、前期准备：

l 模板DNA提取与纯化：从细胞、血液或组织中提取DNA/RNA，去除蛋白质、多糖等杂质。DNA建议用TE缓冲液保存于-20℃，RNA需置于-80℃。

l 引物设计：根据目标序列设计特异性引物，确保退火温度匹配。

2、反应体系配置：

l 包含模板DNA、引物、Mg²⁺、DNA聚合酶及缓冲液。

l 热启动PCR需额外添加修饰物（如抗体）抑制酶活性。

3、循环程序：

l 初始变性（94-98℃，5分钟）→ 循环变性（93-98℃，30秒）→ 退火（50-65℃，30秒）→ 延伸（72℃，1分钟）→ 重复25-35次 → 最终延伸（72℃，5分钟）。

4、产物分析：

l 普通PCR：琼脂糖凝胶电泳检测条带大小。

l qPCR：通过荧光信号积累曲线定量分析。

l 胶回收：若存在非特异扩增，需跑胶后回收目的片段纯化。

PCR成功率取决于细节控制。PCR技术作为分子生物学基石，持续推动生命科学边界拓展。其核心价值在于将不可见的DNA片段转化为可量化、可分析的宏观产物，为人类理解生命本质和应对健康挑战提供关键工具。