ELISA实验中的非特异性吸附的避免方法

非特异性吸附是指在固液界面上，溶液中的待测化合物由于静电作用、疏水作用等非共价键作用力，被吸附到固体表面的现象。非特异性吸附会影响样品的真实浓度和分析结果的精确性，导致标准曲线的提取回收率不一致，出现高浓度点信号偏高，低浓度点信号偏低的情况。此外，它还会影响色谱峰型和产生进样残留，从而影响结果的准确性。

避免ELISA实验中的非特异性吸附，可以采取以下策略：

一、封闭步骤优化

1、‌封闭剂选择

优先使用1-5% BSA（牛血清白蛋白）或5%脱脂奶粉，封闭未结合位点。

对高背景样本可尝试酪蛋白（1%浓度）或商业封闭缓冲液。

2、‌封闭条件控制

37℃封闭1-2小时或4℃过夜，确保充分覆盖孔板表面。

封闭液需与样本基质匹配（如血清样本建议用含0.05% Tween-20的PBS）‌。

二、样品处理与稀释

1、优化样品稀释：使用含0.5%-1%牛血清白蛋白（或0.1%白明胶）的溶液稀释检测血清和酶标记抗体，能增强特异性吸附。样品首先用稀释的健血清孵育，也有助于去除非特异性显色。

2、控制酶标记抗体浓度：酶标记抗体浓度太高易出现假阳性，太低则不灵敏，需通过实验确定待测样品、酶标记抗体和抗抗体的最适浓度。

三、缓冲液与洗涤优化

1、合理使用添加剂：在洗涤液或稀释液中添加吐温20，其为非离子型表面张力物质，常用含吐温20的PBS作洗涤剂或稀释样品和酶标抗体，使用量一般在0.06%-0.1%，洗涤效果比牛血清蛋白溶液（0.5%）好，能减少非特异性吸附并增强抗原抗体结合。

2、规范洗涤操作：正确的洗涤是保证ELISA结果可重复的关键步骤，无论是手工还是机器操作，都要通过洗涤消除残留在板孔中未结合的物质及非特异性吸附的干扰物质，以达到分离游离和结合酶标记物的目的。

四、更换试剂或材料

如果怀疑是抗体或固相材料的问题，可以尝试更换不同的抗体或使用不同材质的96孔板，以减少非特异性吸附。例如，如果使用的是玻璃基质的芯片，可以考虑更换为海藻酸基质的芯片，因为某些固相材料可能由多层基质组成，不同的材质可能会影响非特异性结合。

五、提高分析物的纯度

尽可能去除分析物中的杂质，通过提高分析物的纯度、使用高质量的缓冲试剂或对粗样品进行处理（如离心）来减少非特异性结合。

六、实验操作条件控制

1、控制温育条件：反应一般需在25℃下进行4-5h，若要减少反应时间可升至37℃，虽对灵敏性和准确性稍有影响，但能将保温时间缩短至2-3h，对结果影响不大，37℃因此被经常采用。同时，要严格按照试剂最佳反应模式控制温育温度和时间。

2、规范加样操作：加样时应将所加物加在ELISA板孔底部，避免加在孔壁上部，防止溅出和产生气泡。对于间接ELISA标本，稀释时要保证加样准确，尤其稀释倍数大时，很小的绝对误差会导致较大相对误差。

3、确保酶标仪性能稳定：酶标仪作为记录测定结果的仪器，其性能稳定与否决定结果的可靠度，需保证其处于良好工作状态。

通过这些方法的综合应用，可以有效地减少ELISA实验中的非特异性吸附，提高实验的特异性和准确性。