蛋白质印迹（WB）实验具体过程

WB，蛋白质印迹(Western blotting)又称免疫印迹(immunoblotting)，是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术，具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。免疫印迹常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。

WB实验具体过程：

1、收集蛋白样品

蛋白提取的质量直接决定着 WB 结果的好坏，因此，根据标本类型和检测类型选择合适的蛋白制备方法是至关重要的。

使用Western及IP细胞裂解液裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品，为了防止蛋白的降解，或保证磷酸化或乙酰化蛋白的稳定，需要额外添加蛋白酶抑制剂 / 蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂等蛋白抑制剂、或者乙酰化酶抑制剂混合物。

对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白的细胞核蛋白提取试剂盒 、细胞浆蛋白细胞膜蛋白与细胞浆蛋白提取试剂盒、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组分蛋白，也可使用商业化的试剂盒进行提取。

收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。目前常用BAC试剂盒测定样品蛋白的含量。

2、电泳

（1）蛋白样品的变性

取相同质量的细胞裂解液（体积×蛋白质浓度），并加等体积的sds-page蛋白上样缓冲液，若样品是非变性的，可加入非变性的上样缓冲液。电泳样品加入样品处理液后，要经过高温处理，其目的是将SDS与蛋白质充分结合，以使蛋白质*变性和解聚，并形成棒状结构。样品处理液中通常还加入溴酚蓝染料，溴酚蓝指示剂是一个较小的分子，可以自由通过凝胶孔径，所以它显示着电泳的前沿位置，当指示剂到达凝胶底部时，即可停止电泳。另外样品处理液中也可加入适量的蔗糖或甘油以增大溶液密度，使加样时样品溶液可以沉入样品凹槽底部。至此，电泳样品已准备就绪，可立即使用也可以分装冻存，-20℃存放的样品可稳定保持数月。

（2）电泳凝胶制备

电泳凝胶的制备可以直接使用sds-page试剂盒进行操作。

（3）上样和电泳

冰上冷却后，把将处理好的蛋白样品按照预定的顺序上样到SDS-PAGE胶加样孔内中。注意的是加样孔有多时，可加入等体积的上样缓冲液，最后记得点上预染蛋白质分子量Marker。预染Marker便于在电泳过程中监测蛋白质分离，也可以在随后的转膜步骤中指示转移效率。Marker也用样品缓冲液调整至与样品等体积。

加足够的电泳缓冲液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次，以免交叉污染。

3、转膜

（1）、*常用于Western Blot的转移膜主要是聚偏二氟乙烯（Polyvinylidene Fluoride, PVDF膜。

（2）、在加电泳转移缓冲液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜。

（3）、将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。（一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。）在垫子上垫三层滤纸（可三张纸先叠在一起在垫于垫子上），一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。

（4）、要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。（撬时一定要小心，玻板很易裂。）除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破。小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻除去气泡。将膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖下后不可再移动）并除气泡。在膜上盖3张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。（转移液含甲醇，操作时要戴手套，实验室要开门以使空气流通。）

4、封闭

杂交膜上有很多非特异性的蛋白质结合位点，为防止这些位点与抗体结合引起非特异的染色和背景，一般用惰性蛋白质或非离子去污剂封闭膜上的未结合位点来降低抗体的非特异性结合。封闭剂应该封闭所有未结合位点而不替换膜上的靶蛋白、不结合靶蛋白的表位，也不与抗体或检测试剂有交叉反应。常用的封闭试剂有 5%的BSA或者脱脂奶粉，缓冲液一般选择 PBST或者TBST，或者封闭液。

一般封闭条件为：室温或者 37℃缓慢摇荡1～2h，特殊情况也可 4℃过夜。根据结果情况调整封闭试剂的浓度和类型。比如有时 BSA 比脱脂奶粉更有利于降低非特异性背景，而有些抗体则在脱脂奶粉封闭的情况下才能得到清晰的背景。

封闭完成后要进行洗膜，以去除膜上未结合的封闭试剂。

5、一抗和二抗孵育
一抗孵育

按照适当比例用TBST或者一抗稀释液稀释一抗。

吸尽封闭液后，立即加入稀释好的一抗，室温或4℃在摇床上缓慢摇动孵育1～2小时。如果一抗孵育一小时效果不佳，可以在4℃缓慢摇动孵育过夜。

回收一抗。然后加入Western洗涤液或者TBST，在摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5-10分钟。共洗涤6次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。

二抗孵育      

按照适当比例用TBST或者二抗稀释液稀释二抗

吸尽洗涤液后，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在摇床上缓慢摇动孵育1～2小时。

然后加入Western洗涤液或者TBST，在摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5-10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。

前2步洗涤是为了洗去一抗和二抗的非特异性结合，洗涤的效果直接影响结果背景的深浅，所以洗涤一定要干净。洗涤液使用 TBST 或者 PBST，其中的 Tween20 有助于去除非特异性的结合，减少背景。同时短时间多次的洗膜（如 5-6次，每次 3分钟）比 长时间少次数的洗膜更有效。

Western结果通常需要提供内参作为对照，通常可以选用Tubulin抗体、Actin抗体或GAPDH抗体，进行内参检测。

6、显色反应

底物发光法：将两种显色底物1：1等体积混合后将其覆盖在膜表面使其均匀，用玻璃胶片把膜包起来，马上在暗室中将X光片覆盖在膜的上面（时间根据光的亮度来衡量），显影、定影。（荧光在一段时间后会越来越弱，要控制好时间）

7、蛋白膜的重复利用

如果蛋白样品非常宝贵，可以使用Western一抗二抗去除液或者TBST处理蛋白膜，以重复利用蛋白膜。