elisa定量试剂盒试验过程

elisa定量试剂盒试验过程
1、试剂：
（1）考马斯亮蓝试剂：
考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% H3PO4，用蒸馏水稀释至1000ml, 滤纸过滤。zui终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G—250, 4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。
（2）标准蛋白质溶液：
纯的牛血清血蛋白，根据其纯度同0.15mol/L NaCl配制成100 ug/ml蛋白溶液。
2. 器材： （1）可见光分光光度计 （2）旋涡混合器
3、标准曲线的制作
试管编号 0 1 2 3 4 5 6
100ug/ml标准蛋白（ml） 0.0  0.1 0.2  0.3  0.4  0.5  0.6
0.15mol/L NaCl （ml） 1  0.9  0.8  0.7 0.6  0.5 ? 0.4
考马斯亮蓝试剂 （ml） 5 5 5 5 5 5 5
摇匀，1h内以0号管为空白对照,在595nm处比色 
A595nm 
以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug），在坐标轴上绘制标准曲线。
4、样品中蛋白质含量的测定
另取两支干净的试管（做一重复），加入合适浓度的待测样品，使其测定值在标准曲线的范围内，测定方法同上，由样品液的吸光度查标准曲线即可求出含量。
注意事项：
1、如果要求严格，在试剂加入后的5~20min内测定光 吸收，因为这段时间内颜色是zui稳定的。
2、若选择在旋涡混合器上混合，注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除。
一、实验目的
用bradford法测蛋白浓度，测定未知蛋白质浓度样品的吸光度，根据标准曲线得到蛋白质的浓度。配制一组浓度分别为0.10mg/ml，0.08mg/ml，0.06mg/ml，0.04mg/ml，0.02mg/ml，0mg/ml的牛血清蛋白（BSA）溶液，测定这组溶液的吸光度，得到蛋白质浓度对吸光度的一条标准曲线。测定未知蛋白质浓度样品的吸光度，根据标准曲线得到蛋白质的浓度。
二、bradford法测蛋白浓度实验过程
1．准备所需的药品和仪器。
2．计算所需配制的溶液的量。
先配制1mg/ml的牛血清蛋白（BSA）母液，再往母液中加入磷酸缓冲溶液（PBS）配制一组浓度分别为1.0mg/ml，0.8mg/ml，0.6mg/ml，0.4mg/ml，0.2mg/ml的BSA溶液，再将这组溶液稀释10倍，得到一组浓度分别为0.10mg/ml，0.08mg/ml，0.06mg/ml，0.04mg/ml，0.02mg/ml的BSA溶液。计算*步稀释各组需要的BSA溶液及PBS溶液的体积。
BSA体积（ul） 100 80 60 40 20
PBS体积（ul） 900 920 940 960 980
BSA浓度（mg/ml） 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2
3．具体操作过程。
用天平称量1.00g牛血清蛋白（BSA），溶于去离子水中，配成100ml的溶液，溶液的浓度为10mg/ml。用移液枪分别取100ul，80ul，60ul，40ul，20ul的BSA溶液，置于1.5ml的EP管中，再分别加入900ul，920ul，940ul，960ul，980ul的磷酸缓冲溶液（PBS）配成1ml的溶液，震荡使溶液混合均匀。得到一组浓度分别为1.0mg/ml，0.8mg/ml，0.6mg/ml，0.4mg/ml，0.2mg/ml的BSA溶液。
移液枪分别移取100ul刚配好的一组BSA溶液，置于1.5ml的EP管中，各加入900ul的PBS溶液，震荡使溶液混合均匀。得到一组浓度分别为0.10?mg/ml，0.08mg/ml，0.06mg/ml，0.04mg/ml，0.02mg/ml的BSA溶液。另外量取1ml的PBS溶液（BSA溶液浓度为0?mg/ml）作对照试验。
用移液枪分别移取50ul配好的一组BSA溶液，滴加到孔板中，再分别加入200ul的考马斯亮蓝（CBB）。静置10min后，用酶标仪测得这组BSA溶液的吸光度。
bradford法测蛋白浓度实验结果
通过用Bradford法测蛋白浓度，得到的吸光度对BSA浓度的关系曲线为y=3.09x+0.6807，R2=0.9541。可以看出吸光度—浓度的关系曲线中R2值较小，即测得的吸光度与浓度的线性不是很好。究其原因可能有以下两点：一是移液枪的操作不是很熟练，二是移液枪在移液过程中存在着气泡，使移的液体体积不准确。
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