elisa定量试剂盒原位杂交实验操作步骤

elisa定量试剂盒原位杂交实验操作步骤
一质粒制备

1质粒的转化和扩增

1.1制备XL1-Blue感受态细菌

1.取400uLXL1-Blue菌种加入到含200mllb培养基的锥形瓶中，37℃、100rpm培养4h，离心，倒置，以冰冷的0.1mol/LCaCl_2重悬细菌，冰浴30min，离心，弃上清，倒置，再加4ml(含15%甘油)冰冷的CaCl2重悬细菌，分装(200μ/tube)，-80℃保存。

2.转化：在冰浴中将1管XL1-Blue感受态菌解冻，将浓度为2ng/μ1的质粒dna4μ1加入到8Oμ1感受态菌中。

3.轻轻摇匀，冰浴30min。

4.42℃热激9O秒，然后迅速冰浴2min。

5.加入LB培养液(无氨苄青霉素)0.8ml，在37℃，100转/min水浴孵育60min。

6.取200μl菌液铺于琼脂板上(涂有X-Gal(20mg/ml)-IPTG(200mg/ml)的LB-氨苄青霉素50mg/ml,1μl/ml培养基)，待菌液全部被吸收后，倒置平板于37℃培养12-16h。

1.2鉴定和挑选含重组质粒的菌落

1.用无菌牙签挑取单菌落，接种到10ml含氨苄青霉素的LB培养液的离心管中，于37℃，200转/分培养2h，取1ml之一eppendorf离心管，加50μl10mmol/LEDTA(pH8.0)。

2.加入50μl新配置的0.2mol/LNaOH、0.5%SDS、20%蔗糖溶液后，振荡30秒。

3.在70℃温育5min，然后冷却到室温。

4.加1.5μ14mol/LKCl和0.5μ1含0.4%溴酚兰染液，振荡3O秒后，冰浴5min。

5.12000g，4℃离以3min，以除去细菌碎片。

6.制备1%的琼脂糖凝胶(含EB0.5μg/ml)，取50μl上清液加入到样品孔中，其中一孔加入中等分子量DNAMarker。恒压50V，进行电泳。

7.当溴酚兰迁移到凝胶全长的2/3-3/4时，停止电泳，在紫外灯下检查质粒DNA分于量的大小是否与转入质粒相符。

1.3质粒的扩增和纯化

1.用无菌牙签分别挑取单个白色菌落移入含30mlLB-氨苄青霉素(50μg/ml)培养液的聚丙烯管中，于37℃，200转/分培养3h。

2.将菌液转入含70mlLB-氨苄青霉素培养液的250ml锥形瓶中，37℃，200转/分培养过夜(12-16h)，细菌浑浊。

3.菌液中加入氯霉素液(34mg溶于lml乙醇，100ml菌液加入0.5ml氯霉素溶液，终浓度为170μ/ml)。37℃，200转/分培养12-16h。

4.将培养的细菌倒入50ml的离心管中，6000rpm，4℃离,th,15min，沉淀细菌。

5.弃净上清夜，用2ml预冷的溶液I，悬浮菌体沉淀，剧烈振荡，于室温静置5min

6.加入新配制的溶液II4ml，快速用手晃动10秒，颠倒数次后，于室温静置10min。

7.加入预冷的溶液III3ml，温和振荡l0秒，于冰上静置10min，出现白色絮状沉淀。

8.6000rpm，4℃离心15min，保留上清。

9.将上清(若带细菌残片，则再次离心)移入另一50ml的离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇混匀，于室温静置10min。(或-20℃4h，或4℃过夜，可便核酸沉淀)

10.12000rpm，4℃离心15min，回收核酸。小心弃去上清，倒置离心管使残兼上清液流尽。

11.于室温用70%的乙醇洗涤沉淀物和管壁，室温12000rpm离心，15min，充分弃去乙醇，于室温将离心管倒置在纸巾上，使zui后残余的痕量乙醇挥发殆尽。

12.用500μlTE(pH8.0)溶解核酸沉淀，转移至1.5mlEppendorf管中。

13.加入用冰预冷的5mol/L的LiCl溶液600μl，充分混匀。12000rpm，4℃离心15min，以沉淀高分子量的RNA。

14.将上清转移到另一1.5mlEppendorf管中，加等量异丙醇，充分混匀，于室温静置10min。

15.12000rpm,4℃离心15min，回收核酸。小心弃去上清，倒置离心管使残余上清液流尽。

16.于室温用70%的乙醇洗涤沉淀物和管壁，室温12000rpm离心，15min，充分弃去乙醇，于室温将离心管倒置在纸巾上，使zui后残余的痕量乙醇挥发殆尽。

17.400μl含无DNA酶的RNA酶(20μg/ml)的TE缓冲液(pH8.0)溶解沉淀，将溶液转移到另-1.5mlEppendorf管中，室温放置1.5mlEppendorf管中30min。

18.加入400μl13%(v/v)的PEG8000-NaCl(1.6mol/L)，混匀，4℃12000rpm离心5min以回收质粒DNA，弃去上清。

19.加入400μlTE缓冲液(pH8.O)溶解沉淀，再分别用等体积的Tris、酚：lvfang：(25：24：1)、和lvfang各抽提一次。

20.将水相(上清)移入另一1.5mlEppendorf管中，加入O.1体积(约50μ13M的醋酸钠(pH5.2)和2倍体积(大约1ml)的无水乙醇，充分混匀后于4℃放置30min。

21.于4℃12000rpm离心5min回收沉淀的质粒DNA。尽可能弃去上清，敞开管口，置工作台上使残留的痕量乙醇蒸发殆尽。

22.加入400μl处于4℃的70%乙醇，稍加振荡，漂洗沉淀，4℃12000rpm离心2min。

23.吸去上清，室温敞开管口，直到乙醇*挥发。

24.用100μlTE缓冲液(pH8.0)溶解沉淀。

25.取4μl溶液1：100稀释后，测定其OD260、OD280，以确定质粒DNA的纯度和浓度(OD260/OD280>1.8。OD260/OD280对DNA而言其值大约为

1.8，高于2.0则可能有RNA污染，低于1.8则有蛋白质污染。;DNA浓度=OD260X0.05X稀释倍数(μg/μl)。

26.质粒DNA溶液于-20℃保存待用。
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