elisa定量检测试剂盒Northern转膜操作步骤

elisa定量检测试剂盒Northern转膜操作步骤

elisa定量检测试剂盒转膜前的RNA琼脂糖凝胶电泳参照RNA分离中的电泳方法，根据需要选用适当的 分子量Marker.

1.在一个标准变性凝胶电泳完成后，凝胶用DMPC-H2O淋洗，以除去甲醛，然后置于 2×SSC(20×SSC用DMPC-H2O稀释)中浸泡15～30min.。

2.构建转移平台：在塑料盒上横放一块玻璃板，玻璃板应比塑料盒长，但比塑料盒窄。剪一块与盒子等宽但长度是盒子长度2倍的滤纸，将其横放在玻璃板上，滤纸两头垂入盘中，用20×SSC浸湿滤纸，并向盘中加入足量的20×SSC。

3.用锋利的小刀将凝胶边缘无用部分修去，并在靠加样孔的一放左上角切去一小块作为凝胶方位的记号。将凝胶置于平台中央，用玻棒滚动除去气泡，然后用石蜡膜封住凝胶四周边缘，避免覆盖样品部位。

4.剪一片与凝胶暴露面同样大小的尼龙膜，在无RNase的水中浸泡5min.，然后将其放置在凝胶上面，膜的一条边缘应刚好重叠覆盖于加样孔的边缘。膜置于凝胶表面后即不应轻易挪动，膜与凝胶之间不应留有气泡。

5.取两张与尼龙膜同样大小的滤纸，elisa定量检测试剂盒用20×SSC浸湿后置于膜的上方，用玻棒赶出气泡。切一叠略小于滤纸的纸巾，将其置于滤纸上方，在纸巾上平放一玻璃板，然后在玻璃板上压一重物，室温下转膜4～6小时或4℃过夜。

在转膜过程中，要保证塑料盘中有足够的20×SSC，当纸巾浸湿后，要及时更换。

6.拆卸转膜装置，翻转凝胶和膜使凝胶的一面朝上，置于一张干的滤纸上，用软铅笔在膜上标记凝胶加样孔的位置。

7.取下凝胶，用2×SSC洗膜，再置于两张干滤纸上使膜晾干。

8.交联：方法1. 将膜夹于两张滤纸之间，在80℃真空烘烤0.5～2小时;方法2. 将膜置于一可透过紫外线的塑料保鲜膜中，将有RNA的一面朝下，用紫外透射仪照射合适时间。带正电荷的尼龙膜适度照射可促进RNA上小部分碱基与尼龙膜表面带正电荷的胺基形成交联结构，从而增强杂交信号。但过度照射确会使RNA上更大一部分胸腺嘧啶共价结合于尼龙膜表面，导致杂交信号减弱。

对于湿润的尼龙膜，总照射剂量为1.5 J/cm2，而干燥尼龙膜总照射剂量为0.15 J/cm2。

9.转膜效果检测：如果需要，可对转移上RNA的膜进行染色检查转膜效果。将交联后的膜浸入5%冰醋酸中，于室温浸泡15min.，elisa定量检测试剂盒再将膜转移至亚甲蓝染液中，室温下浸泡5～10min.。可见明显的5s和18s两条RNA带，mRNA呈现模糊带型。