琼脂糖凝胶电泳检测DNA的实验原理

琼脂糖凝胶电泳检测DNA的实验原理

[实验仪器与设备]

1. elisa定量检测试剂盒恒温培养箱 2. 琼脂糖凝胶电泳系统

3. 高压灭菌锅 4. 紫外线透射仪

[实验材料]

1.三羟甲基氨基甲烷(Tris) 2.硼酸

3.乙二胺四乙酸(EDTA) 4.溴酚蓝

5.蔗糖 6.琼脂糖

7.溴化乙锭 8.DNA marker

9.DNA样品

[实验步骤]

1.缓冲液的配制

① 5×TBE(5倍体积的TBE贮存液)

配1000ml 5×TBE:

Tris 54g

硼酸 27.5g

0.5mol/l EDTA 20ml

Ph8.0

② 凝胶加样缓冲液(6×)

溴酚蓝 0.25%

蔗糖 40%

③溴化乙锭溶液(EB) 0.5μg/ml

2.制备琼脂糖凝胶

按照被分离DNA的大小,决定凝胶中琼脂糖的百分含量。可参照下表：

琼脂糖凝胶浓度 线性DNA的有效分离范围

0.3% 5-60 kb

0.6% 1-20 kb

0.7% 0.8-10 kb

0.9% 0.5-7 kb

1.2% 0.4-6 kb

1.5% 0.2-4 kb

2.0% 0.1-3 kb

3.胶板的制备

(1)elisa定量检测试剂盒 用高压灭菌指示纸带将洗静、干燥的玻璃板的边缘(或电泳装置所皿备的塑料盘的开口)封住，形成一个胶膜(将胶膜放在工作台的水平位置上，用水平仪校正)。

(2) 配制足够用于灌满电泳槽和制备凝胶所需的电泳缓冲液(1×TBE)。准确称量的琼脂糖粉。缓冲液不宜超过锥瓶或玻璃瓶的50%容量。 在电泳槽和凝胶中务必使用同一批次的电泳缓冲液，离子强度或pH值的微小差异会在凝胶中形成前沿，从而大大影响DNA段的迁移率 。

(3) 在锥瓶的瓶颈上松松地包上一层厚纸。如用玻璃瓶，瓶盖须拧松。在沸水浴或微波炉中将悬浮加热至琼脂糖溶解。注意：琼脂糖溶液若在微波炉里加热过长时间，溶液将过热并暴沸。应核对溶液的体积在煮沸过程中是否由于蒸发而减少，必要时用缓冲液补充。

(4) 使溶液冷却至60℃。加入溴化乙锭(用水配制成10mg/ml的贮存液)到终浓度为0.5ug/ml，充分混匀。

(5) 用移液器吸取少量琼脂糖溶液封固胶模边缘，凝固后，在距离底板0.5-10mm的位置上放置梳子，以便加入琼脂糖后可以形成完好的加样孔。如果梳子距玻璃板太近，则拔出梳子时孔底将有破裂的危险，破裂后会使样品从玻璃板之间渗透。

(6)将剩余的温热琼脂糖溶液倒入胶模中。凝胶的厚度在3-5mm之间。检查一下梳子的齿下或齿间是否有气泡。

(7)在凝胶*凝固后(于室温放置30-45分钟) ，小心移去梳子和高压灭菌纸带，将凝胶放入电泳槽中。

低熔点琼脂糖凝胶及浓度低于0.5%的琼脂糖凝胶应冷却至4℃，并在冷库中电泳。

(8)加入恰好没过胶面约1mm深的足量电泳缓冲液。

4.加样

DNA样品与所需加样缓冲液混合后，用微量移液器，慢慢将混合物加至样品槽中。此时凝胶已浸没在缓冲液中。 一个加样孔的大加样量依据DNA的数量及大小而定，一般为20-30μl样品。

已知大小的DNA标准，elisa定量检测试剂盒应同时加在凝胶的左凝胶的左侧和右侧孔内。确定未知DNA的大小。测量未知DNA的大小时，要所有样品都用相同的样品缓冲液。