健康原代细胞转染实验前准备及步骤

① 从健康原代细胞开始
Ⅰ 转染实验前，细胞解冻后传代3–4次。 这使得细胞从解冻过程中恢复过来，并恢复正常的生长速度。
Ⅱ 仅使用活性 >90%的细胞——使用台盼蓝染色可轻松测定细胞活性。
Ⅲ 定期传代细胞，切勿让细胞长到汇合状态或过度生长。如果让细胞长到汇合状态，可能会改变细胞的生长速度以及形态。
a. 请在汇合率达到90%之前对细胞进行传代。我们建议您使用胰酶替代物Cellstripper™试剂(Corning 25-056-CI)使细胞脱壁。Cellstripper™试剂可于室温下存储在通风橱中。可通过添加过量的Cellstripper™来跳过PBS洗涤的步骤，然后吸弃全部液体，仅留可覆盖瓶子表面的液体。
* 非酶类细胞分离溶液，其配方是螯合剂的配方，可温和分离组织培养物的贴壁细胞。性质比胰酶更温和。
b. 传代条件取决于所用的细胞系。 部分经验法则：
对于快速生长的细胞，倍增时间为16小时(如HEK-293)，按1：10的比例分瓶。
对于生长缓慢的细胞，倍增时间为36小时(如原代细胞)，按1：5的比例分瓶。
Ⅳ 保留冻存的细胞系，并定期解冻新细胞。 传代次(>30–40)时，细胞的生长速度和形态会改变。

② 进行实验之前，请先规划您的实验。
务必要熟悉实验方案、确定所需的材料量，并在开始实验前确认所需的一切物品条件均已齐备。
Ⅰ 开始前，设计好铺板路线图，标注好每次处理或实验条件。
Ⅱ 计算所需脂质体和DNA的储备量，并确认有足够的下列材料：TransfectGRO减血清培养基(Corning 40-300-CVR)，Lipofectamine® 2000 或Lipofectamine® LTX试剂，以及DNA (0.5–1 µg/µL)。

③ 转染时，请使用DNA。
Ⅰ 使用无内毒素的试剂盒和实验方案制备DNA。
Ⅱ 通过测量OD 260/280值来确定DNA纯度，测得的OD值应介于1.7–1.9]之间。数值过高或过低均说明有杂质，不宜用于转染实验。
Ⅲ 在无DNA/RNA酶的水或TE中稀释DNA。
Ⅳ 制备的工作浓度为0.5–1 µg/µL。 可用SpeedVac®浓缩仪或透析过滤装置(例如，Millipore Amicon®超滤管)来浓缩DNA。

④ 转染当天，将细胞铺板。
Ⅰ 如果在转染前一天或更早时间铺板，转染效率可能下降。
Ⅱ 转染时，细胞密度保持在汇合率为70–90%。
Ⅲ 转染时，细胞密度影响转染效率。 为了简化转染优化过程或节省时间，我们建议细胞铺成2种不同的密度，以确保较高的转染效率。
Ⅳ 细胞的铺板和转染可同时进行，或者通过反向转染操作进行。 反向转染操作中，使用的细胞是正常/正向转染的2.5倍以上。
Ⅴ 转染复合物可以加到含抗生素和血清的培养基中，且不会影响转染效率。

⑤ 准备脂质体-DNA复合物。
Ⅰ 为了获得试验结果，我们建议在TransfectGRO培养基中混合脂质体和DNA。 另一种方法是使用无血清培养基。
Ⅱ 在TransfectGRO培养基中稀释脂质体。 在第二管Opti-MEM®培养基中稀释DNA，然后和等体积脂质体溶液混合。 该2步稀释法可获得更的数据，比脂质体直接加入稀释的DNA中的方法获得的结果更有重复性。
Ⅲ 脂质体一旦在TransfectGRO培养基中稀释，在加入稀释的DNA之前，孵育时间为2- 5分钟。 稀释的脂质体孵育时间不要超过20]分钟。
Ⅳ DNA的TransfectGRO溶液更加稳定，Z早可以提前4小时制备，但不要太早。
Ⅴ 原代细胞等体积稀释的脂质体和DNA溶液等体积混在一起后，通过缓慢地上下吹打来混合溶液，也可轻弹试管底部，或者快速涡旋混合。
Ⅵ 脂质体/DNA复合物温育5-10小时后，将复合物转移到含有细胞和生长培养基的孔中。 将复合物滴加到培养基上，然后轻轻地晃动板子。 切勿剧烈地将孔中的脂质体/DNA复合物分散，否则会使细胞移位。
130573-200701    50mg    鉴别
130576-200901    50mg    有关物质
130579-200901    100mg    有关物质
130585-201001    100mg    HPLC含量
130593-200901    200mg    HPLC含量
130601-201001    50mg    有关物质
130605-201001    50mg    有关物质
130650-200901    50mg    有关物质
135001-201002    11.9g/400ml    培养基适应性
135002-201002    11.4g/400ml    培养基适应性
135003-201002    9.0g/400ml    培养基适应性
原代细胞