原代细胞培养及外源基因导入的实验步骤

原代细胞的传代培养（*天） 
   1) 显微镜观察母细胞的生长状态，确定传代比例。 
为了获得较高的转染效率，必需保证细胞处于合适的生长密度，因此应根据母细胞的生长密度调整传代比例。磷酸钙转染的合适细胞密度为50％－70%，本实验中使用的293细胞长成致密单层后一般按照1：6传代即可。 
   2) 在酒精灯旁打开培养皿盖，倒去皿中的细胞营养液，加入2mlHank’s液，轻轻摇动，将溶液倒出。 
   3) 消化与分装。 
在培养皿中加入1ml消化液（0.53mMEDTA, 0.05%胰蛋白酶液），37°C静置5分钟左右，显微镜观察，如果细胞变圆且彼此分离表明消化*，此时可加入10ml营养液终止消化，吹打数次，使培养皿壁上的细胞全部脱落下来，并分散形成均匀的细胞悬液。按照传代的比例补加适当体积的营养液，吹打混匀后分装到新的培养皿中。 
在分装好的细胞培养皿上做好标记，置于37°C二氧化碳培养箱中培养。 
2. 用磷酸钙介导的外源质粒转染法在293细胞中过量表达TNF－R1（第二天） 
   1) 显微镜观察待转染细胞的生长状态 
      a. 观察细胞是否污染 
      b. 观察培养液颜色的变化 
      c. 观察细胞的生长密度 
   2) 转染 
      a. 用微量移液器在1.5ml离心管中依次加入10μg（1μg /μl, 10μl）质粒DNA（实验组为TNF-R1的哺乳动物细胞表达载体，对照组为空载体），350μl超纯水，40μlCaCl2(2.5M)溶液，混匀。 
      b. 在另一1.5ml离心管中加入400μl2×HBS，将A液分三次缓慢加入，每次加入A液后用吹气泡的方法混匀。室温静置5分钟。 
      c. 将A，B混合液均匀地滴加在待转染的293细胞培养液中，轻轻晃动使混匀。将培养皿置于37°C二氧化碳培养箱中。 
3. 凋亡细胞的形态观察，“DNA Ladder”的提取及琼脂糖电泳分析（第三天） 
   1) 显微镜观察过量表达TNF-R1（实验组）和空载体（对照组）的293细胞形态上的差异。 
   2) 用10ml玻璃吸管将实验组和对照组培养皿中的细胞轻轻吹打下来，收集到15ml离心管中，2000rpm离心5分钟，沉淀用1mlPBS重悬，转移到1.5ml离心管中，2000rpm离心3分钟，去除上清液，加入200μlPBS(0.2mg/ml 蛋白酶 K)，重悬细胞，再加入200μlPBS（2％NP40），颠倒混匀，4°C作用30分钟，期间颠倒数次。12,000rpm离心2分钟，吸出上清，加入1ml乙醇，颠倒混匀，－20°C静置10分钟，12,000rpm离心10分钟，沉淀溶于50μl水中，原代细胞加入RNaseA(10mg/ml)，37°C静置20分钟。 
   3) 在DNA溶液中加入10μlDNA上样缓冲液，取出50μl进行2％琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶成像仪拍照。
小鼠核因子κB亚基p65亲和肽(NF-κB p65)     白介素31受体aIgG    肠道菌
小鼠黑色素(MC Ab)     白介素2受体γ链IgG    大肠杆菌
小鼠横纹肌辅肌动蛋白α (sm Actinin-α)     白介素2IgG    大肠菌群
小鼠红生成素(EPO)     白介素26IgG    大肠菌群
小鼠环孢素A(CsA)     白介素-22受体IgG    大肠菌群
小鼠环孢素A(CsA)     白介素22受体结合蛋白IgG    肠道菌
小鼠环磷酸鸟苷(cGMP)     白介素-22IgG    大肠杆菌
小鼠黄体生成素释放激素(LHRH)     白介素21受体IgG    大肠菌群
小鼠活化蛋白C(APC)      白介素21IgG    大肠菌群 粪大肠菌群 大肠杆菌
小鼠活化素A(ACV-A)     白介素20受体β链IgG    大肠菌群 大肠杆菌
原代细胞