做蛋白表达实验的时候，有时候实验会觉得参考实验方法和ke隆的蛋白基因序列没有问题，蛋白电泳就是没有结果。今天就一起来探讨一下蛋白质不表达的原因有哪些呢？
1.载体构建错误
这个屡见不鲜，很多新人经常弄错读码框。比如Qiagen的pQE系列载体，其ke隆位点常有一两个碱基的区别；另外有些酶产生粘端有些酶产生平端，这些都容易导致读码框错误，从而表达不出来。
2.宿主菌选择不当
不同的宿主菌其基因型是不一样的。有些经过特殊修饰的载体，或者特殊用途的载体，或者有特殊启动子的载体，必须选择合适的宿主菌进行表达。因此，当你的蛋白没有表达出来时，可以考虑更换宿主菌。
3.密码子的使用频率低
有些基因其本身含有许多稀有密码子，尤其是起始密码之后的15个碱基之内的稀有密码子，对蛋白表达有着很重要的影响。优化密码子对原核表达似乎效果很好，对真核表达系统未见得有很好的效果。曾经有某人在毕赤酵母表达某蛋白两年未果，试图将密码子优化进行表达，结果还是没有表达。一气之下将该优化的基因序列克隆到原核表达载体，表达量居然出奇地高！这是一个辛酸的笑话，但是一个真实的故事。但是有一点我可以有很大把握的说：对于真核表达，密码子优化只能起锦上添花的作用（确认有表达，以此来提高表达量），而不能雪中送炭（没有表达出来，通过密码子优化极有可能不奏效）。
4.质粒不稳定或者质粒丢失
pET系统通常比较稳定。但是你选用带氨苄青霉su抗性的载体时，也许有可能产生β-lactamase降解了抗生素，使质粒丢失。还有一种情况是表达重组的毒素蛋白，对宿主细胞也有毒性，造成质粒丢失。这种情况多见于真核表达系统。
5.蛋白酶将蛋白降解了
这种情况常由重组蛋白本身的N-或C-端序列引起的。当蛋白N-端是Arg, Leu, Lys, Phe, Trp,或 Tyr这些氨基酸时，容易遭受蛋白酶降解，此即N-末端规则。N-端是Met时，大肠杆菌可以悄悄地把这个Met偷走，特别是Met后紧跟着一个带小侧链的氨基酸时。C-末端存在非极性氨基酸时，也容易导致蛋白被降解。C末端最后5个氨基酸是极性的或者带电荷的，则不易被降解。
6.二级翻译起始位点
这种情况见于你的序列里正好含有和核糖体结合位点一致的序列。那就怪不得人家了，核糖体会很高兴地找到这个位点，然后开始翻译，致使你的蛋白被截短，在电泳时看不到预期大小的片段。
7.SD序列
这个不陌生吧？考研时老师喜欢出名词解释，也难怪人家老是拿这个出题----SD序列和起始密码子序列（80%是AUG，也有GUG的）之间的距离，对蛋白表达的效率也有着非常重要的影响。SD序列本身的组成对翻译效率也有影响。有时为了减少包涵体的产生，还特别对SD序列进行修饰呢！
8.mRNA的二级结构
在克隆之前，你得看看你的序列里是否有和核糖体结合位点和/或翻译起始位点互补的序列。如然，你最好进行同义密码子替换。否则由此形成的mRNA二级结构，会让翻译嘎然而止的。
9.意外终止
这种情况见于PCR扩增序列时，会和你开个不大不小的玩笑。比如它会将序列中间TAC突变为TAA，让你的蛋白翻译刹车。所以在进行表达之前，一定要进行测序，避免这种情况的发生。
10.转录终止子
转录终止子的存在可以促进蛋白表达；但是缺少时就会造成“通读"，没完没了地读下去。这在pET系统里不成问题，因为它在靶基因的相反方向有个选择性的标记基因。如果你的靶基因正好和这个标记基因方向一致，那么你得看看你的靶基因后是否有个转录终止子。如果没有的话，它们会竞争得天昏地暗，抢着生成mRNA和蛋白质。
11.mRNA的不稳定性
靶基因的mRNA常聚集于细胞内。但是大肠菌的mRNA及其不稳定。如果在mRNA的5"-非翻译区和3‘-rho非依赖性终止子处插入稳定结构序列，可以促进mRNA的稳定性。尤其是5"末端要是有个不带突出的发夹结构，能让mRNA在胞浆内无生命之虞。
12.检测方法的可行性
有时候，蛋白的确表达了，只是表达量特别低，或者和杂带靠得特别近，致使你错误地以为蛋白没有表达。这时候，你可千万别忘记了生物学实验的两大黄金准则：对照和重复。说到对照，有很多层意思。最基本的意思是，要设立空载体对照。在真核系统表达的蛋白，常常量特别低。因此你不要老是想着WB和SDS-PAGE去检测。这时候，你必须多看文献，另辟蹊径，从文献中找找看这个蛋白有米有很特别的性质----比如说如果它具有酶活性，那简直就是便宜你了。还比如说，某些蛋白具有异样性质，比如说流感病毒的HA，你拿表达的不同梯度稀释的蛋白做个血凝。如果发生血凝，并且呈现一定的梯度关系，那简直就是板上钉钉的事情了。
以上就是关于蛋白质不表达的原因有哪些的问题解答。如果你想了解更多请咨询百奥创新客服！
