实时荧光定量PCR检测方法

如要对DNA、RNA样品进行精确定量研究，就需要采用实时荧光定量PCR，根据检测实时荧光PCR产物的方式不同，实时荧光定量PCR主要有DNA结合染料法、基于探针的化学法、淬灭染料引物法等类型。

1. DNA结合染料法

原理：应用一种带有荧光的、非特异的DNA结合染料检测PCR过程中积累的扩增产物。

应用于核算定量和基因表达验证。

优缺点：它们的优点是可以对任何双链DNA 进行定量，不需要探针，具有相对高的灵敏度和可靠性，并且成本低，简单易用，缺点是它们能在反应中结合所有的DNA双链，其中包括在PCR过程中产生的引物二聚体或其他非特异产物。

染料法一般使用的是SYBR Green I染料，这是一种可以与双链DNA小沟结合的荧光染料，不会与单链DNA结合，并且在游离状态下几乎无荧光，只有与双链DNA结合才会发出荧光，因此将PCR扩增产生的双链DNA数量与荧光强度直接关联，产生实时监测的效果。

2. 基于探针的化学法

原理：应用一个或多个荧光标记的寡核苷酸探针检测PCR扩增产物；依赖荧光能量共振传递检测特异性扩增产物。

应用于核酸定量、基因表达验证、等位基因鉴别、SNP分型、病原体和病毒检测、多重PCR。

优缺点：探针法的鉴别能力远远大于DNA结合染料法，因为它们只与目的产物结合，从不与引物二聚体或其他非特异产物结合，缺点是它的合成价格高。

探针法中的TaqMan探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭基团则在3’末端，PCR扩增时在加入引物的同时加入探针，探针完整时，荧光信号被淬灭基团吸收，PCR扩增时，5’→3’外切酶活性将探针酶切降解，使荧光基团和淬灭基团分离，从而检测器可以接收到荧光信号。

图3 TaqMan探针荧光信号产生机制

3. 淬灭染料引物法

原理：采用荧光标记引物扩增，从而使荧光标记基团直接掺入PCR扩增产物中，依赖荧光能量共振传递。

应用于核酸定量、基因表达验证、等位基因鉴别、SNP分型、病原体和病毒检测、多重PCR

优缺点：探针和目标片段的特异性结合产生荧光信号，因此减少了背景荧光和假阳性，还可进行多重PCR扩增，缺点是原料成本价格高。