聚合酶链反应(PCR)一般操作步骤

聚合酶链反应（Polymerase chain reaction,PCR)是一种在体外快速扩增特定基因或 DNA 序列的方法。

一般操作步骤：

1.反应体系与反应条件的选择

现在市面上的商品化的 DNA 聚合酶有多种，里面也配备了相应的 Buffer，包含各种所需的催化离子与缓冲液的成分，实验时只需要按照说明书加以稀释并配制反应体系即可，有时也可以同等比例放大或缩小，需要说明的是同等比例的放大或缩小并不意味着实验产物同等比例的缩放。

2.酶的选择

早期的 PCR 扩增是由大肠杆菌 DNA 聚合酶Ⅰ的 Klenow 片段完成的，但是这种酶不耐热，每一个循环之后都需要加入新的酶。从嗜热水生菌(Thermus aquaticus)中提取的 Taq DNA 聚合酶在较高温度下依然保留活性，避免了繁琐的操作，简便了 PCR 的步骤。现今，各个公司对酶的称呼不一，很多经过 Taq 酶改造而来，也有其它来源的 DNA 聚合酶，建议综合考虑保真性、扩增速度、操作简便性、价格等衡量因素选择合适的 DNA 聚合酶。此外，过高的温度以及过长的时间对 DNA 聚合酶的活性都有影响。

3.循环参数的设定

依据实验目的而定，一般的检测质粒构建是否成功，20-24 个循环就可以；而对于构建过程获得 PCR 产物来说一般 28-34 个循环左右。循环数太小，获得的产物不够，循环数太多浪费时间，产物的特异性也不一定好，不是循环数越多越好。

注意事项：

1.变性温度不能过高，会影响酶的活性，变性温度低，解链不全，导致引物不能结合，得不到扩增产物；

2.退火温度与引物的 Tm 值有关；

3.依据实验目的调整反应体系，使得 PCR 过程经济、高效。