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免疫荧光（immunofluorescence）是一种常用的光学显微术，即用荧光显微镜来观察细胞中的特定生物分子。免疫荧光依赖于抗体抗原的特异性结合，然后通过直接标记或间接标记方法使用荧光分子指征抗体-抗原结合的位置，以确定目标生物分子在细胞中的位置、丰度和分布情况。那免疫荧光实验流程是怎样的呢？一起来学习一下吧！
1. 固定
固定液种类：有机溶剂（甲醇、乙醇、丙酮等）；交联剂（4%PFA、10%中性福尔马林），固定液的选择取决于被研究抗原的性质及所用抗体的特性。但针对磷酸化的抗体，不适合用甲醛，会导致磷酸蛋白从膜表面转移到胞浆中，故应选择冰冷的无水甲醇或无水乙醇，同时应注意甲醛会挥发，在4-8°C不宜储存太久。
固定时间：取决于组合块的大小和类型，对于大多数组织，18-24h较为理想，细胞固定时间较短，一般2%的甲醛室温固定20min即可。
2. 透化
通透的目的是使抗体进入胞内。0.5% Triton X-100 室温通透20 min（针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则省略该步骤）；除了Triton X-100，丙酮也可作为通透剂，并且丙酮固定后的样品不需要通透。
3. 封闭
封闭可减少一抗和二抗与非特异性位点结合。通透后用PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加山羊血清，室温封闭30min。常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或者是羊血清。从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。醛类固定的样品，在用一抗孵育前用含0.3M gan氨酸的封闭液进行封闭。
4. 一抗孵育
根据一抗说明书，按照适当比例用一抗稀释液稀释一抗，用吸水纸吸尽封闭液，每张玻片滴加稀释好的一抗并放入湿盒， 4℃孵育过夜。回收一抗，加入PBST， 在摇床上缓慢摇动洗涤5 min，共洗涤3次。
5. 荧光二抗孵育
用吸水纸吸尽洗涤液后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中孵育1h后，回收二抗，接着用PBST洗3次，每次5 min；由于荧光容易淬灭，故从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都要避光。
6. 复染核（定位的关键）
在玻片上滴加DAPI，并注意避光孵育5min，对标本进行染核，然后用PBST洗3次，每次5min，洗去多余的DAPI。
7. 封片
用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察。
以上就是有关于免疫荧光实验流程问题全部解答，如果你有更多补充请咨询百奥创新客服哦~
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